3D 打印鈦小梁支架緩釋低氧誘導(dǎo)外泌體介導(dǎo)雙重仿生骨再生

來(lái)源：EFL生物3D打印與生物制造

當(dāng)前臨床上面臨的主要問(wèn)題是，嚴(yán)重創(chuàng)傷、腫瘤切除或感染等導(dǎo)致的大段骨缺損修復(fù)困難，傳統(tǒng)治療方式如自體骨移植存在供體不足和并發(fā)癥，異體骨移植有免疫風(fēng)險(xiǎn)，合成材料支架則缺乏骨誘導(dǎo)性和血管化能力，鈦合金（Ti-6Al-4V）植入物雖力學(xué)性能優(yōu)異，但存在彈性模量過(guò)高（≈110 GPa）導(dǎo)致應(yīng)力屏蔽、表面生物惰性難以促進(jìn)血管生成等局限。   

來(lái)自南方醫(yī)科大學(xué)黃文華教授、吳耀彬教授以及胡孔和主任醫(yī)師團(tuán)隊(duì)、暨南大學(xué)利時(shí)雨副教授團(tuán)隊(duì)合作開(kāi)展了相關(guān)研究，他們開(kāi)發(fā)了一種雙重仿生策略，設(shè)計(jì)了3D打印仿生小梁多孔鈦合金支架（BTPS），并通過(guò)微流控技術(shù)制備了負(fù)載低氧誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源外泌體（HExo）的PEGDA/GelMA水凝膠微球（PGHExo），利用聚多巴胺（pDA）修飾將微球錨定在支架表面（BTPS&pDA@PGHExo）。該支架通過(guò)Voronoi算法模擬天然骨小梁的幾何結(jié)構(gòu)與力學(xué)性能（彈性模量≈3.2 GPa，滲透率11.52×10⁻⁸ mm²），結(jié)合HExo的持續(xù)釋放（體外釋放≥30天），協(xié)同促進(jìn)成骨分化和血管生成。   

相關(guān)工作以“3D-Printed Titanium Trabecular Scaffolds with Sustained Release of Hypoxia-Induced Exosomes for Dual-Mimetic Bone Regeneration”為題發(fā)表在《Advanced Science》上。

圖1. BTPS&pDA@PGHExo支架用于大段骨缺損修復(fù)的制備流程及治療機(jī)制示意圖。

1. 仿生小梁鈦支架的設(shè)計(jì)與制備，通過(guò)Voronoi算法結(jié)合股骨松質(zhì)骨CT數(shù)據(jù)建模，并利用選擇性激光熔融（SLM）3D打印技術(shù)，制備了孔隙率70%、平均孔徑560 μm的BTPS鈦支架。通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）、能譜分析（EDS）及工業(yè)CT驗(yàn)證，結(jié)果顯示支架表面光滑、元素分布均勻（Ti/Al/V比例符合Ti-6Al-4V標(biāo)準(zhǔn)），內(nèi)部孔隙連通性良好，力學(xué)測(cè)試表明其彈性模量為3.2 GPa，接近天然松質(zhì)骨。      

圖2. 仿生小梁鈦支架（BTPS）的結(jié)構(gòu)表征與元素分析。   

2. 支架力學(xué)性能與流體動(dòng)力學(xué)分析，采用有限元分析（FEA）模擬支架在500 N壓縮載荷下的應(yīng)力分布，結(jié)果顯示最大應(yīng)力454.26 MPa，無(wú)應(yīng)力集中；計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)（CFD）顯示支架內(nèi)流體流速均勻（無(wú)湍流），滲透率為11.52×10⁻⁸ mm²，證實(shí)其力學(xué)穩(wěn)定性和物質(zhì)傳輸效率。壓縮測(cè)試進(jìn)一步驗(yàn)證支架屈服載荷達(dá)3085.25 N，符合承重需求。      

圖3. 支架力學(xué)特性與流體動(dòng)力學(xué)模擬。   

3. 低氧誘導(dǎo)外泌體（HExo）的提取與表征，通過(guò)多步超速離心從低氧培養(yǎng)的HUVECs中分離外泌體，利用TEM、納米顆粒跟蹤分析（NTA）及Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示HExo呈球形、粒徑約100 nm，低氧條件下VEGFA表達(dá)及蛋白濃度顯著高于常氧組，且對(duì)HUVECs的促血管形成能力呈劑量依賴(lài)性（200 μg/mL時(shí)血管網(wǎng)絡(luò)面積最大）。      

圖4. 低氧誘導(dǎo)外泌體的分離、表征與促血管化活性。   

4. PEGDA/GelMA水凝膠微球（PGHExo）的制備與釋放特性，利用微流控芯片技術(shù)制備平均粒徑80 μm的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠微球，通過(guò)流變學(xué)測(cè)試證實(shí)其儲(chǔ)能模量（G′）高于單一GelMA凝膠，體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示HExo呈持續(xù)釋放模式（18天累計(jì)釋放率約80%），熒光追蹤顯示微球在體內(nèi)外均能穩(wěn)定釋放外泌體達(dá)4周以上。      

圖5. 外泌體負(fù)載水凝膠微球的制備與釋放動(dòng)力學(xué)。   

5. 支架表面改性與體外生物相容性評(píng)估，通過(guò)聚多巴胺（pDA）涂層將PGHExo錨定至BTPS表面，SEM顯示微球均勻分布，EDS檢測(cè)到C/N/O/P元素證實(shí)微球成功結(jié)合?；?死細(xì)胞染色顯示BTPS&pDA@PGHExo組MC3T3-E1細(xì)胞存活率顯著高于對(duì)照組，ALP活性及茜素紅礦化結(jié)節(jié)形成量均最優(yōu)，RT-PCR顯示成骨基因（RUNX2/ALP/OCN）和血管生成基因（VEGF/CD31）表達(dá)顯著上調(diào)。      

圖6. 支架表面改性與體外成骨/血管化評(píng)估。   

6. 支架誘導(dǎo)骨再生的轉(zhuǎn)錄組學(xué)機(jī)制分析，通過(guò)mRNA-seq對(duì)比BTPS&pDA@PGHExo與純鈦支架組的基因表達(dá)，GO富集分析顯示差異基因顯著富集于“骨骼發(fā)育”“血管生成”“MAPK/mTOR/HIF-1信號(hào)通路”，RT-PCR及ELISA驗(yàn)證ALPL、VEGFB等關(guān)鍵基因和蛋白（RUNX2/VEGF）的上調(diào)，揭示外泌體通過(guò)激活多通路協(xié)同促進(jìn)骨再生。      

圖7. 支架介導(dǎo)骨再生的轉(zhuǎn)錄組學(xué)及分子機(jī)制驗(yàn)證。   

7. 兔股骨缺損模型的體內(nèi)修復(fù)效果，通過(guò)顯微CT（μCT）和組織學(xué)染色（亞甲藍(lán)-品紅）評(píng)估，結(jié)果顯示BTPS&pDA@PGHExo組在12周時(shí)新骨體積（28.1 mm³）和骨密度（717.1 mg/cm³）顯著高于對(duì)照組，新生血管密度及成熟骨小梁結(jié)構(gòu)形成量最優(yōu)，證實(shí)其通過(guò)結(jié)構(gòu)仿生與外泌體緩釋的雙重作用實(shí)現(xiàn)功能性骨再生。      

圖8. 支架在兔股骨缺損模型中的體內(nèi)修復(fù)效能。

研究結(jié)論
本研究開(kāi)發(fā)了一種雙重仿生策略，將3D打印鈦小梁支架與低氧誘導(dǎo)外泌體緩釋系統(tǒng)結(jié)合，用于促進(jìn)血管化骨再生。通過(guò)Voronoi算法設(shè)計(jì)的仿生小梁結(jié)構(gòu)（孔隙率70%，彈性模量3.2 GPa）有效模擬天然骨的力學(xué)性能，聚多巴胺修飾的水凝膠微球?qū)崿F(xiàn)外泌體的持續(xù)釋放（體外≥30天）。體外實(shí)驗(yàn)表明，該支架顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞分化（ALP活性提升2.3倍，礦化結(jié)節(jié)面積增加45%）和血管內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)形成（VEGF表達(dá)上調(diào)5.8倍）。體內(nèi)兔股骨缺損模型顯示，植入12周后新骨體積達(dá)28.1 mm³，骨密度恢復(fù)至正常骨的89%，且新生血管密度是單純支架組的3.2倍。轉(zhuǎn)錄組學(xué)證實(shí)，該體系通過(guò)激活MAPK、mTOR和HIF-1信號(hào)通路協(xié)同調(diào)控成骨與血管生成。本研究為解決大段骨缺損修復(fù)中的力學(xué)不匹配和血管化不足提供了新范式，展現(xiàn)出個(gè)性化骨再生治療的臨床轉(zhuǎn)化潛力。

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