3D打印血管化類器官芯片，成功解決類器官“長(zhǎng)不大”的難題！

來(lái)源：摩方精密

類器官是一種能夠復(fù)現(xiàn)特定器官獨(dú)特結(jié)構(gòu)與固有功能的三維（3D）細(xì)胞培養(yǎng)模型。然而，現(xiàn)有類器官技術(shù)存在關(guān)鍵缺陷——缺乏復(fù)雜血管網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致氧氣及必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送受限。結(jié)合其固有的尺寸限制與代謝物累積問(wèn)題，類器官難以模擬真實(shí)器官的天然復(fù)雜性，從而限制其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

為突破這一技術(shù)瓶頸，來(lái)自南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)、摩方精密、昆明醫(yī)科大學(xué)等聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)成功開(kāi)發(fā)出可培養(yǎng)厘米級(jí)腫瘤或器官源類器官的新型培養(yǎng)平臺(tái)。該平臺(tái)通過(guò)摩方精密面投影微立體光刻（PμSL）技術(shù)3D打印定制化類器官芯片，其內(nèi)部集成微米級(jí)仿生微血管網(wǎng)絡(luò)，并引入灌注裝置以模擬血流動(dòng)力學(xué)特征，在實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)液持續(xù)供給與全浸沒(méi)培養(yǎng)的同時(shí)，有效克服了類器官因營(yíng)養(yǎng)獲取不足導(dǎo)致的尺寸受限難題。這一技術(shù)不僅使體外構(gòu)建大尺度腫瘤及正常組織模型成為可能，還為藥效毒理評(píng)估與類器官標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供了創(chuàng)新解決方案。相關(guān)成果以“Vascularized organoid-on-a-chip for centimeter-scale organoid cultivation”發(fā)表于著名期刊《Bio-Design and Manufacturing》上。

基于微納3D打印的微血管類器官芯片
為模擬生理相關(guān)性更強(qiáng)的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)，類器官芯片采用中空管狀結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，單管道內(nèi)徑80μm、壁厚20μm，相鄰?fù)ǖ篱g距400μm。每根通道周向均勻分布四組寬度＜10μm的狹縫，沿管道軸向以300μm為間隔周期性排布。裝置入口與出口直徑均為0.75mm，整體由摩方精密microArch® S230 （精度：2μm）超高精度3D打印系統(tǒng)搭配摩方BIO樹(shù)脂材料一體化成型制備而成。

該裝置通過(guò)中空管狀"人工血管"（圖1a）模擬血管結(jié)構(gòu)主體，其管壁設(shè)計(jì)7-10μm孔徑微孔以實(shí)現(xiàn)生理級(jí)營(yíng)養(yǎng)擴(kuò)散（圖1b-c）。為精準(zhǔn)模擬交叉血管網(wǎng)絡(luò)拓?fù)洌�裝置內(nèi)集成5層仿生結(jié)構(gòu)單元——每層包含14條平行"人工血管"及7條橫向支撐梁（圖1a-b）。生物相容性驗(yàn)證表明：BIO樹(shù)脂浸提液共培養(yǎng)體系對(duì)類器官擴(kuò)增無(wú)不良影響，且在濃度梯度測(cè)試中，人源肺癌（腫瘤組織）、氣道與腎臟（正常組織）來(lái)源類器官的活性均未出現(xiàn)顯著性抑制。

圖1. 利用摩方微納3D打印技術(shù)制造帶有血管的類器官芯片。

肺癌類器官芯片模型的建立
首先，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了肺癌類器官（圖2a），其傳統(tǒng)培養(yǎng)7天后直徑停滯于約200μm（圖2b）。將經(jīng)消化的肺癌類器官懸浮于基質(zhì)膠后接種至毛細(xì)血管芯片，成功實(shí)現(xiàn)類器官片段移植，并持續(xù)培養(yǎng)超過(guò)30天（圖2c）�；�于該模型對(duì)腫瘤類器官長(zhǎng)周期、大尺度培養(yǎng)的顯著支持能力及其獨(dú)特生長(zhǎng)表型，將其命名為"厘米級(jí)腫瘤類器官"（圖2a,c）。Ki67免疫組化證實(shí)肺癌厘米級(jí)類器官的增殖活性顯著高于傳統(tǒng)類器官（圖2d）。

免疫染色驗(yàn)證厘米級(jí)類器官完整保留源腫瘤的病理學(xué)形態(tài)與分子特征（圖2e），甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（TTF-1）及NapsinA抗體共染進(jìn)一步確認(rèn)其肺腺癌來(lái)源屬性（圖2f）。上述結(jié)果表明，在需要大尺寸組織的肺癌模型構(gòu)建中，厘米級(jí)類器官可作為傳統(tǒng)類器官的重要補(bǔ)充體系，且突破常規(guī)尺寸限制實(shí)現(xiàn)了持續(xù)性生長(zhǎng)（圖2g）。在傳統(tǒng)培養(yǎng)中，上皮源性肺癌類器官形成囊狀結(jié)構(gòu)，但因營(yíng)養(yǎng)擴(kuò)散限制導(dǎo)致核心區(qū)域細(xì)胞凋亡。而芯片培養(yǎng)體系呈現(xiàn)三階段生長(zhǎng)特征：早期形成球狀克隆并逐步擴(kuò)增；中期持續(xù)生長(zhǎng)且無(wú)結(jié)構(gòu)崩解；培養(yǎng)12天后類器官間建立緊密連接，形成與含血管網(wǎng)絡(luò)的體內(nèi)腫瘤高度相似的整合結(jié)構(gòu)（圖2g-h）。

圖2.肺癌類器官的建立。

肺癌類器官對(duì)順鉑的敏感性顯著增強(qiáng)
順鉑作為不可切除性非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的標(biāo)準(zhǔn)化療藥物，亦廣泛用于小細(xì)胞肺癌的治療。為評(píng)估厘米級(jí)腫瘤類器官對(duì)抗癌藥物的反應(yīng)特性，本研究首先檢測(cè)傳統(tǒng)類器官對(duì)順鉑的敏感性，測(cè)得肺癌類器官半抑制濃度（IC50）為29.88μmol/L（圖3a）。隨后采用10μmol/L順鉑處理厘米級(jí)模型，藥物干預(yù)5天后即出現(xiàn)大規(guī)模腫瘤細(xì)胞死亡（圖3d-e）；持續(xù)暴露10天后癌細(xì)胞被完全清除（圖3b-c）。免疫熒光成像揭示，同等劑量順鉑在厘米級(jí)類器官中誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)強(qiáng)度顯著高于傳統(tǒng)模型（圖3f-g），證實(shí)厘米級(jí)體系對(duì)順鉑的響應(yīng)靈敏度更高。

圖3. 摩方微納3D打印厘米級(jí)類腫瘤芯片。

子宮內(nèi)膜癌類器官構(gòu)建及藥敏檢測(cè)
為實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)膜微生理系統(tǒng)的高度模擬，本研究充分利用微流控技術(shù)在透光性能及氣體滲透性方面的優(yōu)勢(shì)，構(gòu)建了一種整合血管網(wǎng)絡(luò)的子宮內(nèi)膜癌體外模型（圖4a）。團(tuán)隊(duì)通過(guò)類器官芯片模擬子宮內(nèi)膜血管網(wǎng)絡(luò)，有效支持球狀體類器官的營(yíng)養(yǎng)供給。培養(yǎng)超過(guò)15天后，源自患者的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞成功組建出具備緊密連接的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，其形態(tài)特征高度再現(xiàn)了體內(nèi)腫瘤的實(shí)際情況（圖4b-c）；相較之下，無(wú)灌注的對(duì)照組類器官則生長(zhǎng)停滯并最終解體。病理染色證實(shí)了模型保留源腫瘤的關(guān)鍵病理特征，同時(shí)通過(guò)孕酮受體（PR）、雌激素受體（ER）和細(xì)胞角蛋白7（CK7）的免疫熒光染色結(jié)果，進(jìn)一步明確了模型的子宮內(nèi)膜癌特性（圖4d-e）。

在藥物反應(yīng)評(píng)估方面，相較于傳統(tǒng)類器官模型，本研究的厘米級(jí)類器官在相同卡鉑濃度下表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的藥物敏感性（圖4g-j）。該平臺(tái)還可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期藥效監(jiān)測(cè)：如圖4k所示，隨卡鉑濃度升高，厘米級(jí)類器官細(xì)胞快速死亡。這表明子宮內(nèi)膜癌厘米級(jí)類器官芯片不僅突破腫瘤生長(zhǎng)尺寸限制，更精準(zhǔn)模擬腫瘤微環(huán)境，還為藥物療效評(píng)估提供了更可靠的模型基礎(chǔ)。

圖4. 對(duì)子宮內(nèi)膜癌類器官進(jìn)行為期一周的藥物敏感性測(cè)試。

腎臟類器官培養(yǎng)與腎毒性檢測(cè)
本研究進(jìn)一步將毛細(xì)血管芯片技術(shù)應(yīng)用于腎臟類器官培養(yǎng)領(lǐng)域（圖5a-d）。H&E染色結(jié)果表明，厘米級(jí)腎臟模型保留了原始腎臟的組織學(xué)結(jié)構(gòu)特征（圖5e）；通過(guò)免疫熒光檢測(cè)，該模型明確表達(dá)了遠(yuǎn)端腎小管標(biāo)志物L(fēng)RP2以及腎臟遠(yuǎn)端小管標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（ECAD）（圖5f-g）。

為動(dòng)態(tài)評(píng)估順鉑的腎毒性效應(yīng)，研究采用綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記厘米級(jí)腎臟類器官以監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖狀態(tài)（圖5h）。經(jīng)30天培養(yǎng)的模型中施加順鉑處理后，第4天即觀察到細(xì)胞死亡現(xiàn)象，類器官結(jié)構(gòu)瓦解并形成囊泡樣改變，精準(zhǔn)模擬了順鉑暴露下近端腎小管典型的擴(kuò)張病理特征（圖5h-i）；藥物暴露超過(guò)10天后，細(xì)胞死亡率＞50%（圖5j）。上述發(fā)現(xiàn)證實(shí)，毛細(xì)血管芯片技術(shù)可成功構(gòu)建具備天然腎臟組織特性的厘米級(jí)類器官芯片，并能精確復(fù)現(xiàn)順鉑誘導(dǎo)的腎毒性反應(yīng)機(jī)制。

圖5. 腎臟類器官培養(yǎng)及腎毒性檢測(cè)。

微血管提升類器官基因遞送效率
盡管類器官展現(xiàn)出高度仿生的生物學(xué)特性，其培養(yǎng)基質(zhì)形成的細(xì)胞外物理屏障卻阻礙了病毒顆粒的直接侵染，導(dǎo)致重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV）在基因療法中的應(yīng)用受限。為模擬體內(nèi)血管化腫瘤對(duì)病毒感染的敏感性，本研究通過(guò)微流控系統(tǒng)遞送rAAV-GFP并評(píng)估感染效率（圖6a-b）。通過(guò)向厘米級(jí)類器官緩慢注入新鮮病毒懸液實(shí)現(xiàn)深度滲透并與細(xì)胞充分作用，經(jīng)48小時(shí)持續(xù)感染后，基于GFP陽(yáng)性細(xì)胞比率評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，厘米級(jí)類器官的GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及熒光強(qiáng)度比率均顯著高于傳統(tǒng)類器官（圖6c-d），表明血管化裝置顯著增強(qiáng)病毒侵染能力（圖6e），且轉(zhuǎn)染后類器官仍保持良好增殖活性。該厘米級(jí)類器官體系為開(kāi)發(fā)基于rAAV的新型基因治療策略提供了創(chuàng)新平臺(tái)，有望加速基因療法臨床轉(zhuǎn)化并提升治療效益。

圖6. 腺相關(guān)病毒通過(guò)微血管網(wǎng)絡(luò)遞送至厘米級(jí)類腫瘤模型中。

總結(jié)：
本研究展示了利用摩方微納3D打印技術(shù)（microArch® S230，精度：2μm）制造用于器官芯片應(yīng)用的生物芯片。該技術(shù)能夠最大限度地模擬微血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，更真實(shí)地模擬血液循環(huán)過(guò)程以及關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣輸送和代謝廢物清除過(guò)程。應(yīng)用微流控灌注技術(shù)構(gòu)建的器官芯片，成功實(shí)現(xiàn)了腫瘤與腎臟類器官的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)周期突破30天，同時(shí)將組織尺寸擴(kuò)展至厘米級(jí)。這一突破性進(jìn)展克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法中類器官尺寸受限的瓶頸，為藥物毒性測(cè)試及藥效評(píng)估建立了高仿生性研究平臺(tái)。

△microArch® S230A

迭代升級(jí)工業(yè)級(jí)自動(dòng)化超高精度3D打印設(shè)備microArch® S230A是一款針對(duì)精密樣件加工的高性能、高精度、高效率的產(chǎn)品，具有以下突出特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)：

• 高公差控制能力：光學(xué)精度高達(dá)2μm，細(xì)節(jié)公差保持在±10μm;
• 高精密運(yùn)動(dòng)控制系統(tǒng)：XYZ運(yùn)動(dòng)軸的重復(fù)定位精度±0.2μm；
• 自動(dòng)水平調(diào)節(jié)系統(tǒng)：平臺(tái)自動(dòng)調(diào)平、膜面自動(dòng)調(diào)平、滾刀自動(dòng)調(diào)節(jié)三大系統(tǒng)，全面提升打印效率；
• 流平參數(shù)自動(dòng)化：自動(dòng)設(shè)置流平時(shí)間以及滾刀運(yùn)作頻率；
• 液槽加熱系統(tǒng)：地域適配性廣，兼容更多材料加工，滿足多元化的應(yīng)用場(chǎng)景。
  

原文鏈接：https://doi.org/10.1631/bdm.2400424