國立臺灣大學 徐善慧：天然生物材料與應用于生物3D打印技術的研究

臺灣大學醫(yī)療器材研發(fā)中心副主任、組織工程與3D打印中心主任 徐善慧的《天然生物材料與應用于生物3D打印技術的研究》



丁建東：我們和上午一樣，還是先把報告做完一起討論。下一位是徐善慧老師，她是來自于寶島臺灣的，是國立臺灣大學的。我簡單科普一下，臺灣凡是有國立這樣的，沒有民辦這樣的醫(yī)學院。她本身是臺大材料工程學的碩士，徐教授擅長做生物應用，她現(xiàn)在是臺大的醫(yī)療器械研發(fā)中心副主任，他在3D打印方面有專門的研究，結合材料和3D打印。下面我們歡迎徐教授給我們作報告！
    徐善慧：謝謝丁教授的介紹！很高興第二次參加這個論壇，我目前在臺大高分子研究所。
    如果有人聽過我去年的演講的話，其實來之前我一直在想一定要講到不一樣的東西，不要讓大家重復聽到。所以問了一下我要講什么，結果饒經理跟我說去年講合成，今年講天然，但是天然不是我的專長，但我認為這是一個很好的挑戰(zhàn)。
    我自己是做材料，所以我會把重點放在生物3D打印和生物材料，里面有合成高分子材料和天然材料，它們各有優(yōu)缺點。合成材料強度好，沒有水性，天然材料有水性，但需要交流，可能有毒性。在去年8月27號的時候，我曾經想過一個可以水性的合成材料，大家看到我把“沒有辦法水性”這個特點，我把它改過來，寫成可以水性。我做了6張片的片花，給大家回顧一下。
    我們用了PU的系統(tǒng)，因為PCL diol，我可以把它變成水性系統(tǒng)，所以它的好處是水性，不會融于水�，F(xiàn)在這臺打印機，已經完全使用太多年了。好不容易弄出水性的性能，大家可以看到它在低溫情況下是可以列印的。列印出來的東西，它具有高的彈性，不管是哪種形態(tài)，甚至可以變成管子，它也比較有彈性。它的一個好處是在做打印的時候，如果是溶劑的系統(tǒng)和高溫的系統(tǒng)，是沒有辦法把生長因子排入。水性系統(tǒng)，是可以排入生長因子。大家可以看到在3度的空間下，是可以促進軟骨化。我們可以看到把這些干細胞種進去以后，Sox9是高度的強Col。而且特別是我列印的時候加一點點的HA，大家可以看到它的Col 9的現(xiàn)象會顯著下降。這個是列印支架，而支架的一個很大好處，因為它是柔軟了，雖然它卡在那個位置上。我們做了一些粗淺的兔子軟頭缺損修復實驗，可以看到加了這個軟骨以后，在一個月以后它的修復比較良好。
    當然剛剛的水性支架，它是要列印完了之后再把細胞種進去。把細胞種進去，這是第一個層次的組織工程。做下一個層次，是希望把細胞和支架一起打印出來，這是組織工程較高的境界，我把它叫做“君子莫大乎與人為善”，就是能夠把細胞和材料共同印出來。這是用3D打印機打印出來，我們可以看到這里有白細胞。然后我們用了這個列印出來的迷你大腦，里面還有神經干細胞，然后把它植入斑馬魚受損的大腦以后，可以觀察到它的運動神經恢復，也可以發(fā)現(xiàn)之后秘密大腦的存活率增加，如果是腦部損傷，它經過幾天會死亡。從影片就可以看出來，受傷的大腦是不會動的，如果你是一個損傷，在6天之后會死亡。其實這是上次我跟大家分享過的水性和3D列印。
    接下來還有什么可以改善的呢？我們先看第一個改善方案。早上危教授提過把材料變聰明，讓它有形狀記憶。因為它是PU是一個軟連接，我們在置換這個軟連接以后，我們可以讓它有形狀記憶，一個卷曲的東西，過一段時間可以水里面恢復，它在水里面可以很快恢復。另外我們還可以繼續(xù)改善它的軟內斷，讓它可以穩(wěn)固堆疊。因為堆疊實在是一個很大的問題，不過合成的材料，因為它的強度比較高，所以它堆疊幾層是沒有問題的。第三個是什么？從這里我要開始切入今天的主題——天然高分子。我們希望能夠借用天然高分子比較高的生物相容性，以增強它的列印特性。這是我們在天然里面加一些大豆蛋白（SP），然后列印出來。下面這個圖是我做小角度的X光照射，可以看到如果是PU的話，你會看到一個HA，我們就發(fā)現(xiàn)大豆蛋白和PU之間有一些交互作用，會讓它產生扭曲結構，也讓它的列印變得更加容易。但是這里有一個很大的問題，什么樣的問題呢？雖然細胞在里面加了大豆蛋白以后，因為它的生物會長得很好。其實今天這里徐總也提到這種影響很重要。天然高分子有一個很大的好處，就是它的透明�？墒呛铣筛叻肿蛹由洗蠖挂院�，其實大家可以看到它是不透明的。雖然天然的組織是不透明的，但是這是一個很大的麻煩。所以這個細胞如果列印很厚，我還要找很久很久，不知道它到底是不是細胞，因為支架本身也會有一些外掛，所以眾里尋他千百度，不知道那個細胞是不是細胞，所以天然生物材料是非常重要的。
    接下來我就要進入今天的主題，就是天然生物材料、3D打印。
    天然生物材料、3D打印有什么好處呢？是天然構成，在過去多年的文獻里面都有列印，這個列印就可以很好地區(qū)分生物相容性是否好。我自己在過去30年的研究里面，其實天然高分子我做得不多，我只是把它拿來當做一個工具使用，因為我喜歡做合成。但是天然的高分子，我有一點點小小的經驗，我認為這個可以結合生物3D打印。就是什么？列印單顆細胞，我希望能夠列印打印細胞群，一群的細胞。
    我首先跟大家介紹一下，這是我們幾年前的發(fā)現(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)把界面干細胞培養(yǎng)在殼聚糖或者殼聚糖酸感知的玻尿酸上面，這些細胞會自動組裝，然后細胞球。我們認為這個過程是模仿發(fā)育生物學，所以它除了可以讓干性提升，干性提升是所有全球的細胞都發(fā)生的。
    我們這個成球跟別人的球有什么不一樣？大家可以看到它是動態(tài)成球，它是先貼再拉，互相拉扯，然后再把它拉成球。所以我把這個過程取了一個名字，叫“CellAssembly”，就是拉來拉去，就是組裝成一個細胞球。
    這個細胞球還有一個特點，就是因為它是拉來拉去拉成球的，所以跟其他成球方式不一樣，我們可以標定細胞，或者把我們要的的植體基因趁這個過程植入到里面。因為我在這個球的時候做了一個實驗，就是我放了一個SHI、Foxd3，所以我覺得Foxd3很重要。其實我找文獻的時候找到中國有一個平教授，我就寫郵箱給他跟他要Foxd3，他就寄給我。然后我就做了一個實驗，發(fā)現(xiàn)這個球可以量身訂作，拿這個細胞，基于這個成球的過程，把Foxd3不轉進去以后，它就會變成類神經，我們可以在中樞神經里面可以看到，它會讓斑馬魚的中樞神經受損，原來用酒精去把整個中樞神經破壞，但如果是這樣的一個細胞球的話，可以讓中樞神經功能恢復。
    既然細胞球有這么多的優(yōu)勢，我們花很多時間去把這個平臺建立，讓我們再生醫(yī)學使用，那接下來，我這個題目是《天然生物材料的3D打印》，所以我們要回歸，我們用了哪些天然生物材料？第一個想到的是殼聚糖，因為殼聚糖可以讓細胞長得很好。所以我們就用幾滴糖融在醋酸里面，然后用3D打印列印出來的支架，也發(fā)表在2012年。當然發(fā)表之后有一個問題，因為它是醋酸，沒有辦法高細胞列印。幸運的是在2013年，在一個年終會議的時候，有一位教授知道它里面有一個殼聚糖的CF HYDROGNL，它這個CF HYDROGNL就是運用Gelatin，因為這個不需要酸溶，如果你直接讓它打印，它是會溶掉。這個時候他做了一個PEG，然后做成為了這個凝膠，我們在第一期工作里面證明它可以促進神經的修復。在去年的時候，我們又進一步發(fā)現(xiàn)一件事情，我們把這個神經修復的效果水凝膠，發(fā)現(xiàn)殼聚糖并不能促進血管的再生。而且待會兒會證明殼聚糖會抑制癌癥，所以它也能抑制細胞的再生。但是我們只加了一點點天然的Fibrinogen的東西，加了0.002%，加進去以后它就變成了新凝膠。這個膠，可以具有血管修復效果。但是可以看到，如果是正常的LG，它不會修復，如果是加一點凝膠，它的修復效果更高。它這個自修復很快，所以它是一顆一顆的。因為它自修復效果更好，所以它很快就變成了這樣，我們認為這是互穿網路造成的，我們也證明了這應該是互穿網路，因為我們用DFC去證明它的分化和變化。然后我們把剛剛加進去的順序變化了之后，它不會形成互穿，因為互穿網路要搭配形成，一個形成了這個網路，另外一個穿不進去。我們用這個機器證明它是互穿網路，造成了它更好的一些特性。我們也發(fā)現(xiàn)血管內的細胞在種到這個膠里面，它就會成管狀的形態(tài)。我們進一步把它注射在斑馬魚，這個斑馬魚是一個基因改造的斑馬魚，它所有的血管都會有綠色的熒光。這個是一般的PDS打進去，這是正常的血管，在腹部這邊。如果打上水凝膠，會發(fā)現(xiàn)這些血管變少了。但是如果把新的這個加一點，打到斑馬魚的腹部，發(fā)現(xiàn)這邊有大量的血管。我們又進一步用了左下肢缺陷，就是把這個造成缺陷，就這樣打進去之后，就發(fā)現(xiàn)打CF HYDROGNL這一組，老鼠缺血的狀況改善了。
    所以基于剛才的研究，我們認為殼聚糖這一類的東西，應該是一個好的生物3D打印材料。
    我這邊用一個例子說明我們怎么樣打印細胞球。剛剛的細胞球的好處是，它可以把N種細胞自組裝起來。自組裝的時候，會因為下面的基材有變化，造成各種不同層次的特性，這樣就可以模仿發(fā)布生物學上細胞與細胞之間的交互作用。以左邊這個圖來看，可以看到以這個系統(tǒng)來說，缺氧區(qū)域移動，我們認為這會有利于外來血管的形成，這種形成全部是CULTURED，就是核核結構，然后神經干細胞在外面、內皮細胞在里面的細胞球。
    接下來，我們用殼聚糖和這個Gelatin都進行了列印。這個Gelatin是我跟另外一位教授，這個匯報在我前面，有很多人用到。但是它這個要列印，需要一點技巧，因為它固定時間就會交融，你在交融之前就要把它列印出來。我們有試過，不管是Gelatin還是CF HYDROGNL，它都可以列印出來。當然如果要列印多層的話，我覺得它的穩(wěn)定結構，是沒有像合成材料那么好。
    我們也把我們的細胞球跟它共列印之后，發(fā)現(xiàn)經過打印的細胞球，它的結構還在，并不會影響它的增生能力。
    當然，在未來我們希望能夠做多細胞/多材料血管網路生物3D打印列印。剛才也提到沒有血管，它不可能長期生活。我們在今天也運用一個材料，這個材料都可以買到，它對糖類敏感，可以注射出小管。我們可以怎樣？我們可以在任何一個材料里面，我們如果看原先的構想的話，這是哈佛杰尼夫畫的一個圖，他認為不同細胞列印，有些是要做成中空，中空的水凝膠里面長血管。我們也可以用這種合成的方法，來讓膠里面長出血管，這是我們在最近發(fā)表的，可以看到用對糖敏感的水凝膠，中空的CELL LNK就會形成，因為它對糖敏感，然后里面就長出微血管。所以不管是合成或天然的，它都可能會長血管。如果是合成的話，就必須要把它列印出微小的管路，讓它可以長血管。
    接下來給大家看一下神經干細胞和內皮細胞的核殼結構的細胞球，放在Gelatin里面去打印出來的結果，可以看到在長期培養(yǎng)之下，居然內皮細胞好像要伸出來，要長微血管。但是，因為所有天然材料作為一個球來講，所以這好像又要出來又不出來又要躲回去，然后Gelatin分解嗲之前，它還沒有長出來。所以，我們認為它有長血管的潛力，但是目前我們還沒有看到它的生長。這個是混球，這個是罵人的“混球”，它具有血管新生的潛能，因為它所有跟血管新生相關的基因導線都是增加的，在這個打印的細胞球里面。
    所以我們現(xiàn)在要回到原先的大問題了，就是合成材料好還是天然的材料好，也為我去年和今年的兩個不同的題材做一個小結。
    因為我自己不是天然高分子的專家，所以這是我自己個人的意見。
    所以一個生物3D打印墨水必須做到什么？根據(jù)幾年的研究，我有個人一點點小小的淺見。剛剛雜七雜八跟大家分享了很多，所以我在這邊斗膽借用一千年前北宋哲學家張橫渠先生的名句，來跟大家講。第一，它必須在天底之間頂出一個穩(wěn)固的3D空間。如果是用合成和天然材料和比的話，合成好像更勝一籌，因為它的Mechanical比較好。第二個條件是什么？就是它必須要讓每一個細胞活得好好的，所以它必須要很好的生物相容性，這里面牽涉到養(yǎng)分、氧氣的代謝，以這個層次來講的話，天然材料好像又更勝一籌。第三個條件是什么？除了讓細胞存活，你必須要讓細胞在長期，當水凝膠分解之后它能夠存活，而且順利地工作。以剛剛來講，它必須要能夠做代謝。在這個層次來講的話，合成和天然很難說誰好，因為合成的高分子比較容易設計它的DEGRADATION。如果以growht來講，當然是天然比較好。所以這邊我要打一個問號；所以第四個就是要有血管網絡，一定要開通四通五達的血管網絡，才能讓這個列印出來的組織永遠存在那里。我認為這個必須要借用合成和高分子的共同好處。
    所以我簡單做一個小結。我認為在未來，我們可以通過天然高分子和合成高分子的結合，天然高分子有相容的好處，合成高分子有能堆疊的優(yōu)點，然后我們可以運用細胞自組裝或者利用多種細胞的列印，Cell A、Cell B模擬發(fā)育生物學的先進性，讓它們能夠結合起來。
    相信通過這些多元元素的攜手合作，必定能夠共創(chuàng)生物3D列印的大未來，以造福人類，創(chuàng)造20年高質量的生活，70歲到90歲，謝謝！