【解析】構建骨組織工程支架中應用的3D打印技術

骨具有強大的自我修復的能力，但無法完全修復大體積的骨缺損。全世界每年骨缺損的患者數(shù)以千萬計，因腫瘤和創(chuàng)傷而造成的大體積骨缺損是臨床上進行骨修復和移植的主要原因。治療骨缺損最理想的材料就是自體骨，但是自體骨來源有限，同時增加了患者的痛苦，不能滿足臨床需要。骨組織工程的出現(xiàn)，為這一難題提出了新思路。骨組織工程基本出發(fā)點是以“誘導成骨”的方式而非單純以“爬行替代”的方式實現(xiàn)骨的修復和再生。近年來，隨著骨組織工程的研究深入，支架材料的制備以及其制備的方法也成為研究重點。  

骨組織工程支架的傳統(tǒng)制備方法包括溶液澆鑄/離子洗出法、原位成型法、靜電紡絲法、相分離/凍干法、氣體成孔法等，雖然這些工藝也獲得了但比較滿意的效果，但不能實現(xiàn)對支架材料和孔隙結構的精確控制，結構形狀也無法做到與骨缺損部位的解剖結構完全契合，從而不能實現(xiàn)個性化植入物的制備。  

3D打印技術的出現(xiàn)，有效地彌補了這些不足，迅速在骨組織工程支架成型中得到廣泛應用。3D打印技術為快速成型技術的一種，是一種基于三維數(shù)字模型，應用粉末狀或液體的金屬或塑料等可黏合材料，通過逐層打印方式來構造實物的技術。由于其無需模具，可直接根據(jù)計算機三維圖形數(shù)據(jù)“打印”出任何形狀物品，甚至能夠控制所打印物品內(nèi)部細微結構，這使3D打印技術在構建骨組織工程支架的優(yōu)勢得以體現(xiàn)。雖然3D打印技術應用于骨組織工程支架的構建具有很多優(yōu)勢，但仍處于起步階段，應用于臨床扔面臨很多挑戰(zhàn)。  本篇綜述主要包括4個部分，分別為骨組織工程支架、骨組織工程支架中的3D打印技術、用于3D打印構造骨組織工程支架的材料和討論。   

1  資料和方法
1.1  資料來源  
第一作者應用計算機檢索1990年1月至2015年2月MEDLINE數(shù)據(jù)庫、Science Direct數(shù)據(jù)庫、中國期刊全文數(shù)據(jù)庫、維普中文期刊網(wǎng)等有關3D打印技術在構建骨組織工程支架中應用的文章，英文檢索詞“three-dimensional printing， tissue engineering，rapid prototyping technology，scaffold， materials ”， 中文檢索詞“3D打印、組織工程學、快速成型技術， 支架、材料”，排除重復性研究。共檢索到52篇相關文獻，其中外文文獻40篇，中文文獻12篇。

1.2  納入和排除標準  
納入標準：
①文章所述內(nèi)容需為骨組織工程支架構 建的論著或綜述類文章，以及與3D打印技術領域研究成果相關的文章。
②同一領域選擇近期發(fā)表或在權威雜志上發(fā)表的文章。
③文章述及3D打印技術應用于支架構建及兩者之間的關系，闡述其特點及優(yōu)越性并提供充足的理由。
④在涉及材料對比與選擇實驗的文章中，選擇設計合理、干預和對照的措施明確的實驗設計文章。  
排除標準：
①重復性研究。
②實驗設計不合理的文 章。  

1.3  數(shù)據(jù)的提取  
計算機初檢得到52篇文獻，閱讀標題和摘要初篩，排除中英文文獻重復報道的內(nèi)容，及與3D打印或骨組織工程支架不相關的內(nèi)容。  

2  結果
2.1  納入資料基本概況  
符合納入標準的33篇文獻中，文獻是關于骨缺損治療相關報道，文獻是有關傳統(tǒng)支架制備方法的相關報道，文獻是關于支架所需具備的條件相關報道，文獻是關于3D 打印技術優(yōu)勢及要求的相關報道，文獻是關于不同材料的特性及應用進展的相關報道，文獻是有關3D存在局限性與未來發(fā)展方向的相關報道。

2.2  納入資料的研究結果特征   
2.2.1  骨組織工程支架  
在骨組織工程的3個基本要素中(種子細胞、支架材料和生長因子)，支架材料無疑有著舉足輕重的作用，因為一方面，它是信號分子或靶細胞載體，另一方面，它還提供了新骨生長的支架[8]。  在骨組織工程中，理想的支架材料應具有以下條件：
①骨傳導性：材料能為新組織的生長提供通道或媒介的能力。
②骨誘導性：材料可以刺激骨組織的生長。
③良好的生物相容性：材料能促進種子細胞的黏附和增殖分化。
④良好的生物降解性。
⑤足夠的力學性能。
⑥三維多孔結構，能為種子細胞的生長提供空間。
⑦較易加工和消毒性能等。

而對于支架的設計，需考慮以下3個方面：
①能為細胞提供黏附、分化、增殖或遷移的基礎，支架的孔徑尺寸及結構、孔隙率以及表面化學性質(zhì)是影響因素。
②合適的力學強度。
③符合取代部位的解剖學形態(tài)。

圖1  3D打印基本流程

圖注：圖中A，B為第1和第2步：滾軸將薄薄一層原料粉末鋪在工作臺上；C為第3步：噴頭將含有黏結劑的液滴局部噴在粉末床上， 黏結劑周圍的粉末與黏結劑結合，使噴過黏結劑周圍的粉末局部凝固，構成最終成品三維結構的一小部分；D為第4步：鋪有原料粉末的 活塞上升，而鋪有樣品粉末的活塞下降，開始鋪新的一層粉末(重復第2步)，如此反復，直到完整的3D結構被打印完全。

另外，普遍認為3D骨支架孔隙率應大于40%-60%以利于細胞快速擴散和細胞營養(yǎng)物質(zhì)的流動，同時有利于細胞的轉(zhuǎn)移。所以設計與制備支架時需注意與重視骨組織工程支架的要求，選擇最恰當?shù)姆椒ㄅc材料。  

2.2.2  骨組織工程支架中的3D打印技術  
3D打印技術概況：3D打印技術是最早于1989年由麻省理工學院的Emanual Sachs等報道，是一種按需噴射的微滴噴射技術。3D打印系統(tǒng)是在廉價的商用打印機系統(tǒng)上加以改進，增加z軸的運動控制系統(tǒng)，采用系統(tǒng)原有的噴墨裝置或經(jīng)過改裝的注射器陣列實現(xiàn)材料的離散形成。利用這種技術在制備骨組織工程支架時，一般通過打印機將儲存于其中的具有骨修復功能的粉末材料和黏結劑逐層打印出模型結構，黏結劑用于將粉末粒子之間和層與層之間黏結，使其更加穩(wěn)固，最終可形成所需要的骨組織工程三維支架材料。打印材料的微觀結構可以通過很多參數(shù)進行調(diào)節(jié)，例如改變黏結劑的流速，打印的速度及沉積位置等。  

3D打印技術相較于其他快速成型技術，具有的優(yōu)勢有：
①高精度：即高分辨率。
②可以同時打印種子細胞和支架材料，更利于整體三維結構的構建。
③構建速度快。
④可按需構建模型，實現(xiàn)個性化需求。
⑤可根據(jù)需 要設定特定的孔隙率、交聯(lián)，可顯著提高支架的生物學及力學性能從而促進骨組織生長及骨折愈合。另外，從材料的角度來說，幾乎所有種類的粉末只要能夠與黏結劑結合都可以被用來打印。  

3D打印的可伸縮性又使得所打印物品的大小可以從幾毫米到幾米。這些特性大大增加了3D打印使用的自由度[14]。這些優(yōu)點為3D打印技術應用于骨組織工程支架構建提供了理論基礎，也成為投入大量研究于此方法的意義所在。   3D打印技術基本流程：簡單概括為：鋪撒粉末、單層印刷、活塞下降、往復運動和印刷形成5個階段，基本流程如圖1所示。  

3D打印應用于支架構造的要求：3D打印應用于支架構造時，所用粉末和黏合劑需具備一定的條件。粉末要具有一定的流動性、穩(wěn)定性和可濕性。而粉末與黏合劑之間的反應性在3D打印中也起到重要作用。

⑴流動性：所用粉末材料要具有一定的流動性。良好的流動性可以保證滾軸可將粉末鋪成薄薄的一層，同時也利于最終除去多余的粉末。另外，良好的流動性提供了高分辨率的打印效果，也成為3D打印高精度特性的深層原因之一。  流動性主要取決于粒子大小和形狀，粒子越小、形狀越類似球形，則流動性越大。有研究證實分辨率至少是粒子大小的2倍，所以高精度的打印效果依賴于選擇細小的粉末。然而，過小的粉末由于內(nèi)部特殊作用力的原因容易結塊，導致流動性減低。所以在流動性與分辨率之間必須找一個平衡點。  

⑵穩(wěn)定性：粉末的穩(wěn)定性在噴黏結劑時尤其重要。當噴頭噴黏結劑時，體積大約30 pL的液滴以6 m/s的速度沖擊松散的粉末床，這樣會形成類似彈道的一個凹陷，底部是液滴。速度每增加1 m/s，則受影響的范圍直徑增加5-10 μm。  當重新涂布時，最上面一層收到剪切力的影響，很有可能造成所打印出的薄層結構移位，影響最終成品的準確度和完整性。除了此種橫向移位，由重力所產(chǎn)生的壓縮負荷會使所打印出薄層結構的縱向位移。因此，提高穩(wěn)定性、避免這些影響可以從提高黏合強度入手，如添加少量水或者增加粉末床的堆積密度。  

⑶可濕性：粉末的可濕性是另一項重要的要求，它直接影響了打印精確程度和三維結構的原始強度。但太強的可濕性又造成黏結劑擴散范圍太大，降低了打印分辨率。而太弱的可濕性則會由于太大的接觸角或黏結劑的高黏度而造成相鄰層之間的錯位，最終降低機械完整性。  粉末的可濕性取決于多種因素，包括粉末與黏結劑的接觸角、黏結劑噴射速度、粉末床表面的形勢以及粉末與黏結劑之間的化學作用等。目前很難得到可靠的數(shù)據(jù)來定量分析物體的接觸角，尤其對于粉末更加困難。雖然有一些方法用來研究粒子與黏結劑之間的相互作用，如動力學液滴形狀分析，毛細上升方法，粒子流動的方法，但仍處于初級階段，理解尚淺。  

⑷反應性：粉末與黏結劑的反應性在3D打印中也起到重要作用。太高的反應性會限制黏結劑的擴散，而低反應性需黏結劑涂布更加集中。所以反應性能夠影響層與層之間的黏合，最終影響打印的精確度。  對于那些完成3D打印后需經(jīng)燒結處理的支架來說，因為黏結劑受燃燒影響受損會導致最終成品的強度降低。因此想保證足夠的的機械穩(wěn)定性和強度，就必須降低黏結劑的集中程度。  

2.2.3  用于3D打印構造骨組織工程支架的材料
骨組織工程支架構建的材料根據(jù)其性能主要包括人工合成多聚體類、天然高分子聚合物、生物陶瓷及它們的混合物。目前應用最多且最有應用潛力的為生物陶瓷材料，以下作重點介紹。

人工合成多聚體：這類材料以聚乳酸(PLA)，聚羥基 乙酸(PGA)及其共聚物(PLGA)為代表。這類聚合物屬熱塑性材料，可加工成各種結構形狀，并且可以通過調(diào)增分子量、選擇不同聚合方式及成型手段調(diào)節(jié)并控制材料的力學性能和降解速度。因其降解產(chǎn)物無毒及良好的生物相容性，PLA和PGA已經(jīng)通過美國FDA的批準，許可 作為植入物。  

Vacanti等首先將PGA、PLA用作軟骨細胞體外培養(yǎng)基質(zhì)材料，通過組織工程方法獲得新生軟骨成功。Sherwood等通過3D打印技術，制備了上層組分為PLGA/PLLA，下層為PLGA/TCP的軟骨-骨復合支架。研究發(fā)現(xiàn)軟骨細胞更傾向于黏附于支架的軟骨支架區(qū)，培養(yǎng)6周后可以看到軟骨組織的形成。支架的成骨區(qū)力學強度可以達到與人新生松質(zhì)骨同一數(shù)量級。該研究為完全關節(jié)重建技術提供了一種新的方案。  

Tay等用3D打印技術將聚己內(nèi)酯和聚乙烯醇的混合粉末制成準支架，然后再用微粒過濾法將聚乙烯醇除去得到多孔的支架。過濾后的支架疏松柔軟，孔的結構具有高的連通性。  但是人工合成多聚體一般水溶性差，所以溶解其需用到有機溶劑(如氯仿)。氯仿是一種有毒的溶劑，殘留在體內(nèi)會產(chǎn)生毒害作用。雖然利用氯仿提取技術可以減少氯仿，但是仍存在氯仿殘留在支架內(nèi)的風險。另外有機溶劑的使用明顯增加了成本和生產(chǎn)難度，為大規(guī)模批量生產(chǎn)醫(yī)用級支架材料制造了難題。  

天然高分子聚合物：天然高分子聚合物包括膠原、 纖維蛋白、甲殼素及其衍生物和藻酸鹽等，這些天然聚合物生物相容性好，具有細胞識別信號(如某些氨基酸序列)，利于細胞黏附、增殖和分化。天然高分子聚合物一般水溶性較好，可以與無需溶劑溶解的黏結劑結合。所以大量的天然高分子聚合物用于醫(yī)學支架材料的打印。但它們存在一些缺點，如難以大量獲取、降解時難以控制等，故很難單獨作為組織工程中成骨性細胞種植的載體。但其最大的缺點是缺乏一定的機械強度，難以單獨用作成骨細胞培養(yǎng)基質(zhì)材料，可作為良好的材料包埋和添加劑。  

生物陶瓷：以磷酸三鈣(tricalciumphosphate，TCP) 和羥基磷灰石(hydroxylapatite，HA)為代表的磷酸鈣鹽陶瓷是廣泛應用的骨替代材料之一，它們都具有優(yōu)異的骨傳導性能，可不同程度地整合入宿主骨。磷酸三鈣在人的骨骼中普遍存在，是一種良好的骨修復材料。  磷酸三鈣植入人體后，能在體內(nèi)降解為新骨的形成，提供較豐富的Ca和P[25]，由于此特性，以磷酸三鈣為基料的人工骨材料的研究與應用也是當今骨組織工程支架發(fā)展的活躍領域。但是，單純的支架的打印似乎已經(jīng)無法滿足對最后成骨效果的期待。

近年來，支架載藥已成為研究熱點，通過添加藥物的方式來調(diào)節(jié)微環(huán)境，促進成骨細胞的增殖。袁景等利用3D打印的方法，以β-磷酸三鈣粉末為原料，以磷酸二氫鉀為黏結劑，制備載藥(地塞米松、β-磷酸甘油酸鈉、維生素C)骨組織工程支架，并與未載藥支架作對比，結果顯示載藥β-三磷酸三鈣支架在15周內(nèi)基本降解完全，與松質(zhì)骨缺損修復時間相當。骨髓間充質(zhì)干細胞黏附于載藥β-三磷酸三鈣支架表面，并深入支架內(nèi)部，生長良好，增值活躍，細胞堿性磷酸酶活性有提高，說明載藥β-三磷酸三鈣支架具有良好的細胞相容性。另外，將兩種生物陶瓷材料混合也呈現(xiàn)比較好的效果。Zhou等 將磷酸鈣(CaP)與硫酸鈣(CaSO4)混合粉末做為原 料，利用3D打印組織工程支架。結果發(fā)現(xiàn)磷酸鈣與硫酸鈣比率越高，則支架的強度越大。

羥基磷灰石也是廣泛應用于骨組織工程支架的材料。Fierz等以羥基磷灰石和水溶性黏結劑為材料，采用3D打印技術制備了3種類型的圓柱狀中空骨支架，支架直徑3.9-4.2 mm，中心管直徑0.70-0.87 mm，所有支架微孔含量達70%，組織學分析發(fā)現(xiàn)成骨刺激祖細胞可較好地附著于支架。羥基磷灰石一大優(yōu)勢是對骨形態(tài)發(fā)生蛋白具有較強的親和性，Jun等在羥基磷灰石骨組織工程支架中加入含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的涂層，并與不含骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的羥基磷灰石支架作對比，結果發(fā)現(xiàn)實驗組的成骨細胞更加活躍，且骨組織生長情況更好，更加適合作為骨移植替代物的選擇。而羥基磷灰石的弱點在于脆性較大，而純羥基磷灰石不易被吸收，這限制了其應用。  

在生物陶瓷粉末的3D打印中，常用酸來做黏結劑如磷酸和檸檬酸。少量未反應的酸黏結劑殘留一般來講不會產(chǎn)生很大的影響。一些酸如檸檬酸、磷酸和草酸也存在于正常人體內(nèi)，也很容易除去 。剛打印成 型的支架很脆，性質(zhì)不穩(wěn)定，為使其更加兼顧穩(wěn)定，則需在打印完成后將其浸泡在磷酸中使其硬化，或者采用燒結的方法使鈣磷石熱分解而逐漸形成焦磷酸 鹽，硬度增加。  人工合成多聚體材料因其降解產(chǎn)物無毒及良好的生物相容性，已被廣泛應用于骨組織支架，但是由于其水溶性差而需有機溶劑的引入，使支架內(nèi)殘留毒性物質(zhì)的風險增加，限制了其發(fā)展。天然高分子聚合物則水溶性良好，無需有機溶劑的使用，而缺乏機械強度是其最大的缺點，但可作為良好的材料包埋和添加劑。  生物陶瓷既有良好的生物相容性，同時又兼具足夠的機械強度，已成為應用最廣泛的骨組織工程支架材料之一，而幾年來支架載藥的研究又為其提供了新的發(fā)展方向。  

3  討論
3D打印技術應用于骨組織工程支架已取得了可喜的成果，并且蘊含著不可估量的前景。但是目前來講，3D打印應用于骨組織工程支架并不是完美的，仍需認識到其存在的問題與不足。 3D打印的費用比較昂貴，不僅打印設備及運行費用較高，其材料從前期粉末的制成到后期的燒結過程中的 花費也不容忽視，打印1個頭顱模型的花費高達 1 000-2 000美元，這種花費對于中國國情來說并不現(xiàn)實，也限制了其在國內(nèi)的發(fā)展；實現(xiàn)個性化定制雖是3D打印的一項優(yōu)勢，但是，從另一角度講不利于大規(guī)模批量的商業(yè)生產(chǎn)；由于3D打印最初用于工程學而并非醫(yī)學，應用于支架的構建時是一個跨學科的過程，涉及兩個領域的專業(yè)知識，而目前醫(yī)學研究人員與工程學研究人員的研究領域和知識構架相對獨立，缺乏專門的技術人才，這也是今后3D打印更廣泛應用于醫(yī)學所必須解決和改善的問題；另外，在不同粉末材料的選擇上并無統(tǒng)一的標準，在分析各材料的優(yōu)劣性時仍無系統(tǒng)可靠的指標或缺乏充足的實驗證據(jù)，仍需進一步研究從結構、功能、臨床效果等多方面來綜合評價其材料的優(yōu)點與缺點；3D打印后的支架需保持一定的生物相容性，如何增加材料的生物相容性及更接近體內(nèi)微環(huán)境的模擬仍需進一步探索；細胞在3D支架材料內(nèi)部的粘附、生長、分化與細胞與環(huán)境的作用機制仍需大量研究來闡明。  

未來3D打印技術應用于骨組織工程支架的發(fā)展方向主要包括以下3個方面：
①結構設計和制造：制備與正常骨組織具有相似的物理、化學和生物學功能，具有一定生物相容性兼具一定的生物強度。
②多種細胞和生長因子的交互作用：考慮各種細胞以及生長因子的作用，可適當擴大打印的單位，直接打印出帶有血管的骨支架。
③生物支架的保存和活性維持：需要充分考慮如何最大程度維持離體骨支架的細胞活性。

挑戰(zhàn)與希望并存，文章看到3D打印技術在骨組織工程支架中的應用具有巨大的前景，只有同時接受存在的挑戰(zhàn)并逐漸克服，才能發(fā)揮其最大的價值，為未來治療骨缺損提供效率高療效好的治療方法。隨著3D打印技術的不斷發(fā)展、人們對骨組織工程支架材料的研究、工程學與醫(yī)學的不斷交融和相互促進，在不久的將來3D打印一定會在骨組織工程支架的構造領域中大放異彩。

編輯：南極熊
作者：于  強，田  京