文獻精讀 | 3D打印半月板支架用于羊半月板再生

膝關節(jié)中的半月板是股骨遠端和脛骨近端髁間的新月形結締組織，主要起到吸收機械力的作用。半月板損傷后一般行半月板切除術或半月板移植物替代治療。半月板切除術容易暴露股骨和脛骨，進而導致過度磨損，這是骨關節(jié)炎的高度易感因素。而骨關節(jié)炎又是心力衰竭，脊髓損傷，呼吸系統(tǒng)疾病和中風中較為常見的慢性病因之一。一般來說，幾乎所有纖維軟骨組織的相關損傷和疾病，包括半月板，腱-骨連接處，脊柱的椎間盤和顳下頜關節(jié)的缺損均無法自發(fā)愈合。

與大多數其他復雜組織的再生相似，半月板再生的障礙是難以實現多種組織和細胞的再生。半月板由多種結締組織細胞構成，包括外側富含I型膠原基質中的成纖維細胞，以及內側富含硫酸糖胺聚糖（GAG）和II型膠原基質中的軟骨細胞組成。中部部位含有纖維軟骨細胞，既分泌I型膠原也分泌II型膠原。前期的研究表明，利用單細胞難以實現包含復雜細胞群的半月板組織再生。此外，除了外側，半月板的內側與中部缺乏血供的問題也為半月板的修復帶來了困難。

在這篇研究中，作者設計了一種三維打印技術，仿生半月板異質結構，在半月板外側與內側兩個特定的區(qū)域緩釋兩種不同的生長因子，誘導兩個區(qū)域分泌不同的細胞外基質，從而促進半月的再生與修復。

結果與討論：
第一部分
rhCTGF和rhTGFβ3因子用于誘導MSCs細胞成纖維軟骨分化

設計依次用rhCTGF和rhTGFβ3兩種因子按照不同的順序處理MSCs細胞，然后研究細胞成纖維分化情況，主要檢測其中COL-I，COL-II和蛋白聚糖（AGC）的表達。結果表明rhCTGF促進II型膠原和AGC的表達，而rhTGFβ3促進I型膠原的表達。

圖1 （A）利用rhCTGF和rhTGFβ3兩種因子依次處理MSCs細胞后的proCOL-I和proCOL-IIα的免疫熒光分析（C→T（rhCTGF處理 2周，然后rhTGFβ3處理2周），T→C（rhTGFβ3處理2周，然后rhCTGF處理 2周），C + T（rhCTGF和TGFβ3同時處理4周），C4（rhCTGF單獨處理4周）和T4（rhTGFβ3單獨處理4周））。

（B）至（D）為MSCs在經過（A）步驟處理后細胞的COL-I，COL-II和AGC的相對mRNA表達分析。

第二部分
3D打印人半月板支架及體外表征

利用3D打印技術打印聚己內酯（PCL）材料得到人體半月板形狀框架，然后將聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）微球作為緩釋材料分別包裹rhCTGF和rhTGFβ3兩種因子填充到3D打印半月板框架的外側與內側，最終得到人半月板支架，此外，同樣打印不負載兩種因子的3D打印半月板支架（負載空白PLGA微球）作為對照組。體外緩釋實驗表明兩種因子均有良好的緩釋行為。體外種植人滑膜MSCs細胞培養(yǎng)6周后，發(fā)現在支架的外側有大量I型膠原表達，而內側有大量II型膠原表達，這與大鼠的半月板結構一致。體外種植1:1混合成纖維細胞與軟骨細胞培養(yǎng)6周后，阿辛藍染色（觀察蛋白聚糖）、天狼星紅染色（觀察I和III型膠原蛋白）以及免疫熒光染色（觀察I型和II型膠原蛋白）均表明該人半月板支架的外側有較多I型膠原表達，內側有較多II型膠原和蛋白聚糖表達，二者連接處有較為明顯的移行區(qū)界面，符合人體半月板結構特征。

圖2 （A）3D打印人體半月板框架結構。
（B）分別包裹rhCTGF和rhTGFβ3的PLGA微球（μS）被填充到3D打印半月板支架的框架內，并粘附在PCL纖維表面。
（C）分別將CTGF（綠色，40kD）和TGFβ3（紅色，10kD）進行熒光標記，顯示兩種因子被分別負載在人半月板支架的外部與內部區(qū)域。
（D）人半月板支架中的hCTGF和rhTGFβ3體外緩釋數據。
（E）支架在人滑膜MSCs細胞在支架上培養(yǎng)6周后，緩釋的rhCTGF和rhTGFβ3分別誘導細胞在特定區(qū)域表達I型和II型膠原，該結構類似于大鼠半月板。
（F）在人半月板支架上體外種植1:1混合成纖維細胞與軟骨細胞，培養(yǎng)6周后對應阿辛藍染色、天狼星紅染色以及免疫熒光染色結果。

第三部分
3D打印羊半月板支架及體內試驗

根據羊尸體上的天然半月板三維模型數據，3D打印PCL半月板形狀支架，然后分別在內外側負載rhCTGF和rhTGFβ3兩種因子。得到羊半月板支架后進行力學分析發(fā)現該支架有著較羊天然半月板更好的動態(tài)模量（E *），儲能模量（E'）和損耗模量（E“）。手術將其植入到羊內側半月板部位。12周后取出，數碼照片和HE染色結果顯示股骨與脛骨髁上的關節(jié)軟骨幾乎沒有損傷（圖3）。再生半月板取出后分別進行HE染色、天狼星紅染色和阿辛藍染色（圖4），結果表明相比于不負載因子的3D打印半月板支架，負載呈特定區(qū)域分布的兩種因子的3D打印半月板支架在經過12周的修復后有著明顯更加接近于天然半月板的膠原纖維和軟骨基質表達。具體是，實驗組的外側有較多I型膠原表達，內側有較多II型膠原和蛋白聚糖表達，符合羊天然半月板結構特征。

圖3（A）羊半月板的三維掃描，重建以及3D打印獲得羊半月板支架。
（B）3D打印羊半月板支架與天然半月板的動態(tài)模量（E *），儲能模量（E'）和損耗模量（E“）對比。
（C）2-0 縫合線對支架和天然半月板外緣的縫合后拉拔強度。
（D）支架和天然半月板的摩擦系數。
（E）羊半月板內側手術移植。
（F）手術12周后取出的數碼照片與HE染色結果。

圖4（A）羊天然半月板中膠原纖維和軟骨基質的分布。
（B和C）體內移植12周后，可釋放的rhCTGF和rhTGFβ3的實驗組（B）與對照組（C）相比的特定區(qū)域組織學染色。 組織切片用H＆E，阿辛藍（AB）和天狼星紅（PR）染色。
（D）再生半月板外側，中部，內側的HE染色結果。
（E）在體內植入12周后，對照組與實驗組組織學染色的低倍率圖。

將移植12周后再生的羊半月板（對照組與實驗組）和天然半月板分別分為外側，中部，內側三個部分，并依次進行應力松弛試驗力學測試，得到各組各個區(qū)域的瞬時模量（Ei）、松弛模量（Er）和粘度系數（μ）力學數據。同時對三組進行拉伸力學測試，得到楊氏模量、極限強度和極限應變力學數據。結果表明，在相關力學測試結果中，實驗組的力學性能均好于對照組，且接近天然半月板組織。

圖5 移植12周后再生的羊半月板（對照組與實驗組）和天然半月板在各個區(qū)域（外側，中部，內側）的瞬時模量（Ei）、松弛模量（Er）和粘度系數（μ）。
（B）三組的拉伸楊氏模量、極限強度和極限應變數據。

總結：
1.作者提出天然半月板分為內側和外側兩個結構，而且這兩個部分的膠原纖維和軟骨基質成分以及細胞類型不同，外側富含I型膠原基質和成纖維細胞，內側富含蛋白聚糖、II型膠原基質和軟骨細胞。復雜的基質成分和細胞組成成為當前半月板再生的難題。

2. 作者通過設計體外誘導MSCs細胞成纖維軟骨細胞分化，結果表明rhCTGF促進II型膠原的表達，而rhTGFβ3促進I型膠原的表達。這是該項研究的理論基礎。

3. 結合PLGA微球緩釋技術和3D打印技術，制備可以在不同區(qū)域分別緩釋rhCTGF和rhTGFβ3兩種生長因子的3D打印人半月板支架，并體外證明該支架可以誘導細胞在其外側表達I型膠原，內側表達II型膠原和蛋白聚糖。

4. 構建羊半月板缺損模型，并將3D打印羊半月板支架體內移植。培養(yǎng)12周后發(fā)現相比于空白對照組，負載呈特定區(qū)域分布的兩種因子的3D打印半月板支架在經過12周的修復后有著明顯更加接近于天然半月板的膠原纖維和軟骨基質表達。同時力學實驗表明實驗組支架移植后的結果更好，表明了該支架對半月板再生的應用潛力。

來源：科研互助小分隊

參考文獻：
Lee C H, Rodeo S A, Fortier L A, et al. Protein-releasing polymeric scaffolds induce fibrochondrocytic differentiation of endogenous cells for knee meniscus regeneration in sheep[J]. Science Translational Medicine, 2014, 6(266):266ra171. （IF=16.796）

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