阿卜杜拉國王科技大學(xué)開發(fā)3D打印SRS顯微鏡

來源：江蘇激光聯(lián)盟

近年來，微型顯微鏡的出現(xiàn)可為活細(xì)胞進(jìn)行無標(biāo)記成像，而以往許多生物成像技術(shù)需要將熒光染料添加到特定的細(xì)胞目標(biāo)中。來自阿卜杜拉國王科技大學(xué)的研究人員從細(xì)長的燈塔透鏡設(shè)計(jì)中汲取了靈感，開發(fā)了高NA 3D打印顯微鏡，可以更容易觀察皮氏培養(yǎng)皿，并觀察包括癌細(xì)胞生長在內(nèi)的生物過程的分子水平細(xì)節(jié)。

▲圖形摘要

受激拉曼散射(SRS)顯微成像是一種無標(biāo)記的化學(xué)成像技術(shù)，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中具有引人注目的應(yīng)用，其中包括單細(xì)胞代謝、神經(jīng)科學(xué)和組織組織學(xué)。憑借其固有的光學(xué)切片能力，SRS顯微成像技術(shù)可以繪制樣品中化學(xué)鍵的三維分布，其靈敏度允許對生物樣品進(jìn)行視頻速率成像。受激拉曼散射Stimulated Raman Scattering (SRS)是1962年伍德伯里（Woodburry）和恩戈（Ng）偶然發(fā)現(xiàn)的。高強(qiáng)度的激光和物質(zhì)分子發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，使散射過程具有受激發(fā)射的性質(zhì),這種散射光是拉曼散射光，所以這一種非線性光學(xué)效應(yīng)稱受激拉曼散射。受激拉曼散射表現(xiàn)出閾值特性，像激光器一樣只有適當(dāng)?shù)谋霉β什拍墚a(chǎn)生。當(dāng)分子振動由不同波長的兩個激光束相干地驅(qū)動時，會發(fā)生SRS，這兩個激光束在空間和時間上重疊，并且它們的光頻率差異對應(yīng)于分子的振動模式。在這種情況下，被驅(qū)動的相干分子振動會在兩個光束之間傳遞能量，短波長的光束（泵浦光束）會發(fā)生強(qiáng)度損失（受激拉曼損耗），而長波長的光束（斯托克斯束））經(jīng)歷強(qiáng)度增加（刺激拉曼增益，SRG）。

但是，SRS顯微成像的一個缺點(diǎn)是檢測系統(tǒng)受到背景信號的影響，該背景信號稱為交叉相位調(diào)制(cross‐phase modulation,XPM)，它是一種普遍存在的非線性現(xiàn)象，該信號是由激光脈沖與樣品之間的強(qiáng)烈相互作用產(chǎn)生的，會產(chǎn)生虛假的背景信號，從而使SRS測量中的高對比度成像變得困難。為了避免SRS顯微鏡中與XPM相關(guān)的背景信號影響，需要使用能夠收集廣角光的笨重的玻璃物鏡，它們通常具有毫米以下的工作距離，因此，這類鏡頭幾乎不可能安裝在用于培養(yǎng)活細(xì)胞進(jìn)行生物成像的臺式培養(yǎng)箱中。

在這里，研究人員介紹了一個高NA 3D打印聚光鏡，該聚光鏡可安裝在臺式培養(yǎng)箱中，并有效地將原本高度發(fā)散的光束引導(dǎo)到光電探測器。該透鏡具有折反射設(shè)計(jì)，也就是說，它是由折射和反射光學(xué)元件制成的，以實(shí)現(xiàn)較高NA。折射元件在透鏡的中心，收集光束的低發(fā)散部分，而反射元件在透鏡的外部，收集光束的高發(fā)散部分。通過使用此透鏡，研究人員可以在臺式培養(yǎng)箱中測量不含XPM的SRS光譜。根據(jù)研究結(jié)果，這種3D打印顯微鏡頭可以代替體積龐大且昂貴的高NA顯微鏡物鏡，用于點(diǎn)掃描顯微鏡中的前向信號采集。

該高NA 3D打印SRS顯微鏡通過使用激光脈沖從生物樣本中收集分子振動信號。并且SRS顯微鏡能夠以實(shí)時速度生成高分辨率，無創(chuàng)圖像的能力促使研究人員也將其部署到體內(nèi)疾病診斷研究中。

▲3D打印鏡頭的圖像（頂部）。印刷在玻璃基板上的鏡頭3D的光學(xué)圖像（顯微鏡蓋玻片#1,5）（底部）。鏡片中央部分的SEM圖像，顯示菲涅耳狀的中央折射部分和外部反射部分

在校準(zhǔn)試驗(yàn)證實(shí)他們的新透鏡可以拒絕交叉相位調(diào)制背景后，研究人員將目光投向了在傳統(tǒng)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的人類癌細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)表明，這種透鏡可以以類似于傳統(tǒng)SRS顯微鏡的分辨率對細(xì)胞內(nèi)部組件進(jìn)行成像，但方式更加方便，成本也更低。

帶有不同采集光學(xué)元件的受激拉曼散射（SRS）成像。

▲圖解：A，非諧振波數(shù)（2550 cm -1）的IP‐S 3D打印網(wǎng)格的SRS圖像。0.4 NA鏡頭可看到與交叉相位調(diào)制（XPM）相關(guān)的強(qiáng)烈背景，而3D打印鏡頭和高NA顯微鏡物鏡則可抑制這種情況。B，SRS圖像在2950cm -1波數(shù)處，其中光聚合物拉曼光譜具有峰值。C，HepG2癌細(xì)胞在2850 cm -1的SRS圖像，突出顯示了細(xì)胞中的脂質(zhì)滴。用3D打印透鏡抑制XPM偽像可與高NA顯微鏡物鏡相媲美。用1.27 NA顯微鏡物鏡激發(fā)

本文一作Bertoncini表示，通常用來收集SRS顯微鏡信號的物鏡要花費(fèi)數(shù)千美元，現(xiàn)在我們有一個具有類似功能的鏡頭而且這個價(jià)格用不到之前的十分之一來生產(chǎn)。

本文來源：Andrea Bertoncini et al, 3D ‐Printed high‐NA catadioptric thin lens for suppression of XPM background in Stimulated Raman Scattering microscopy, Journal of Biophotonics(2020). DOI: 10.1002/jbio.202000219