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助力3D生物打�。夯�于脫細胞基質生物墨水的3D打印真皮研發(fā)新成果——皮膚創(chuàng)傷患者的希望

背景介紹

燒傷作為第四大最常見的皮膚創(chuàng)傷誘因，除休克和敗血癥外，皮膚創(chuàng)傷處繼續(xù)生長和收縮的瘢痕也是燒傷最嚴重的并發(fā)癥之一，它不僅會損害患者的外貌，還會嚴重影響患者的生理及心理健康。防止瘢痕收縮最先進手段包括早期移植或皮瓣轉移。然而，此類治療可能會導致供體或皮瓣部位瘢痕攣縮，并且常常受到皮膚/皮瓣來源不足等因素制約。因此，臨床實施困難重重。雖然已有部分研究報道結合3D打印及生物墨水制備皮膚類似物用于皮膚創(chuàng)傷修復并已取得很好的實驗結果，但目前的研究大多集中在體外材料介導的細胞反應， 而非宏觀的傷口愈合過程， 且該類生物材料在抑制瘢痕攣縮方面的作用目前尚無足夠的證據和結論進行支撐， 因此探索新型真皮材料的研發(fā)及復合生物3D打印技術將為提高患者皮膚創(chuàng)面修復質量帶來新的希望。

近日，一篇名為“3D-printed dermis-specific extracellular matrix mitigates scar contraction via inducing early angiogenesis and macrophage M2 polarization”關于皮膚表面創(chuàng)傷修復的文章由中山大學附屬第一醫(yī)院燒傷外科祁少海教授研究團隊和中山大學材料科學與工程學院陳永明教授團隊共同在生物醫(yī)學1區(qū)及生物材料1區(qū)期刊Bioactive Materials發(fā)表。

該研究團隊從具備多年臨床應用經驗的豬真皮細胞外基質材料入手， 制備了可以高效保留豬真皮層細胞外基質主要成分的的生物活性粉末， 并利用此粉末制備了可供生物3D打印的溫敏墨水。該團隊使用此墨水， 通過擠出式3D打印方式， 制備出了具有百微米級別空間構型的皮膚真皮結構類似物（PDA）。 實驗結果表明該3D打印制備的真皮類似物具有良好的生物相容性， 可有效促進植皮后的早期血管化， 更有意義的是能夠通過調節(jié)皮膚再生相關基因的表達從而有效抑制植皮創(chuàng)面攣縮而帶來的瘢痕影響。

實驗結果

1.        豬真皮細胞外基質超細粉末（dECM）的制備與表征

首先，通過DAPI、Massons染色和甲苯胺藍染色等實驗方法證明可通過機械破碎方式獲得具有組織特異性的超微細胞外基質粉末和影響局部細胞行為的功能性分子， 如糖胺聚糖（GAGs）等。

2.        利用3D打印技術制備體外皮膚類似物（PDA）

通過流變學測試優(yōu)化并確定了包括打印溫度（18-20°C），墨水濃度（8.5wt%），打印速率（50mm/min）在內的打印參數，利用3D打印方式制備體外皮膚類似物（PDA）。3D打印構建的類皮膚結構經戊二醛交聯(lián)后進行了體外降解及細胞毒性實驗。實驗結果表明，經化學交聯(lián)的PDA在體外降解56天時依然保持良好的結構完整性。通過在PDA表面接種L929成纖維細胞，通過細胞活/死染色和MTT檢測均證明此PDA具有良好的生物相容性。

3.        體內實驗-皮膚傷口移植收縮評估

使用大鼠全皮層創(chuàng)傷模型評價PDA對分層厚皮移植（STSG）中傷口愈合及收縮的評估。實驗結果證明PDA在減少疤痕收縮和促進傷口愈合效果方面優(yōu)于作為陽性對照 （PL）的售類真皮產品Pelnac®。

4.        皮膚移植物術后變化及基因分析

通過不同時間點采集的皮膚移處切片經組織染色表征，發(fā)現PDA可有效減輕傷口纖維化，并在促進膠原沉積成熟的同時對受損毛囊、皮脂腺等附屬器官也有一定的修復。與此同時，通過對代謝和信號通路基因追蹤發(fā)現并確定了PL組和PDA組動物創(chuàng)傷表型的差異是由材料介導的創(chuàng)傷細胞在遺傳水平上的一系列變化引起的。

5.        皮膚移植血管新生分析

研究發(fā)現，在皮膚植入早期，功能性的新血管產生與移植皮膚類似物的正常機理維持有關，新血管的形成可以防止瘢痕形成和相關部委皮膚收縮。本實驗中，通過鏡下觀察移植物周邊微血管密度和相關基因數據判斷移植物植入術后的存活情況。在術后，PDA組微血管數呈現先增加后減緩的趨勢，與此同時，誘導新血管生成，且能促進肝纖維化的Grem1基因檢測顯示PL組中參與新血管形成的相關信號通路相關基因呈上調趨勢，與組織學結果一致。

6.        手術部位巨噬細胞極化

皮膚受傷后會引起一系列的炎癥反應，在所有參與這一反應的免疫細胞中，mϕ表型(M1趨向M2)的轉化不僅是傷口修復調節(jié)的關鍵條件，也是材料-新生組織整合及瘢痕形成的關鍵因素。通過免疫組化CD68、CRR7、CD163對各區(qū)段的巨噬細胞m ϕ表型進行免疫染色評價。實驗結果表明，自第14天起，PDA移植創(chuàng)面中M2比例明顯高于IS和PL移植創(chuàng)面，表明的傷口有助于為再上皮化和從肉芽組織發(fā)育為特征的修復階段向穩(wěn)定階段過渡。

結論

本文報道了一種新穎的用豬真皮脫細胞基質3D打印組裝PDA移植物的抗瘢痕方法，移植PDA可以顯著減少創(chuàng)面收縮和瘢痕形成， 同時PDA植入組表現出高效的早期血管重建，巨噬細胞向M2表型的極化增強，皮膚功能保存較好的修復效應，其修復結果與正常皮膚形態(tài)學相似。本研究通過分子生物學進一步闡述了移植物在皮膚創(chuàng)傷修復、瘢痕形成上的基因調控機理， 同時未來生物材料對皮膚抗瘢痕特性的改善及其臨床可譯性奠定了一定基礎。

Chen L, Li Z, Zheng Y, Zhou F, Zhao J, Zhai Q, et al. 3D-printed dermis-specific extracellular matrix mitigates scar contraction via inducing early angiogenesis and macrophage M2 polarization. Bioactive Materials 2022;10:236-46.

https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.09.008