洞察組織生物打印最前沿！Cell重磅評述

來源： EngineeringForLife


工程化生物人工組織通常由細胞、生物材料和生物分子構成，在醫(yī)學上有著廣泛應用。 這些組織不僅可以用于了解疾病的形成和進展，還可以用于開發(fā)生物替代品來修復或替換受損器官。此外，實驗室培養(yǎng)的組織也可用于開發(fā)人源化體外模型，以驗證藥物的安全性和有效性。生物打印結合了增材制造和組織工程來生成功能性組織和器官。

2022年7月21日發(fā)表在《Cell》上的一篇評述文章對組織生物打印的研究現(xiàn)狀做了總結和進一步的展望，相關內容以“Tissue bioprinting for biology and medicine”為題，作者是來自加州大學洛杉磯分校（UCLA）的Ali Khademhosseini教授和加拿大維多利亞大學的Mohsen Akbari教授。該評述重點介紹了生物打印領域的最新突破，并討論了在該技術廣泛應用于生物學和醫(yī)學之前尚未解決的挑戰(zhàn)。

隨著新支架制造技術（如生物打印、程序化自組裝）的出現(xiàn)、具有細胞調節(jié)能力的新型生物材料的爆發(fā)、新型細胞來源的開發(fā)（例如，誘導多能干細胞）、用于疾病建模和藥物篩選的器官芯片系統(tǒng)的引入以及基因編輯工具（例如，CRISPR-Cas9）的出現(xiàn)（圖1），組織工程領域在過去30年中取得了顯著進展。

△組織工程的進展

組織工程在不同方面取得了進展。 迄今為止，可再生細胞來源、新型生物材料、能夠在細胞水平上控制組織微環(huán)境的小型化系統(tǒng)、創(chuàng)新的生物制造方法和基因編輯工具可用于創(chuàng)建具有類似于天然組織的結構、組成和功能特性的組織模擬物。

盡管這些進步預示著醫(yī)學的光明未來，但仍有許多障礙需要克服。首先，很難概括由不同長度尺度的多種不同細胞和材料組成的復雜活組織。第二個挑戰(zhàn)是在組織制造和成形過程中保持細胞活力和功能。最后，大規(guī)模組織制造需要可擴展的方法，以便能夠在體外快速制造仿生工程組織。

生物打印為在三維空間中沉積細胞和生物活性分子提供了極大的靈活性，并且實現(xiàn)了自動化工作流程，從而最大限度地減少了對細胞的手動操作，提高了組織制造的可擴展性以便進行高通量藥物篩選。

△生物打印的進步增強了組織擬態(tài)和細胞活力

這些進步帶來了幾項技術創(chuàng)新，包括FRESH打印、多材料擠壓和基于光的打印、體積生物打印，以及具有改進細胞相容性的新型顆粒生物墨水。

1. 增強組織擬態(tài)
每種組織都有其獨特的結構（包括不同細胞類型和成分的排布等），以實現(xiàn)特定的功能。例如，心臟是由同步收縮的對齊纖維狀結構構成以實現(xiàn)泵血功能，而肝臟由六邊形結構和大量的、纏繞在一起的血管網(wǎng)絡組成，負責過濾血液供應中的有毒物質并釋放膽汁以幫助消化食物。在幾納米到幾厘米的長度范圍內模擬復雜結構的能力對于最終的工程組織的功能實現(xiàn)至關重要。

為了實現(xiàn)功能性組織的制備，幾種創(chuàng)新的生物打印策略被開發(fā)出來。美國卡內基梅隆大學Feinberg教授團隊提出了一種利用懸浮水凝膠自由可逆嵌入（FRESH）來對膠原蛋白進行3D生物打印的方法，能夠在不同的尺度上直接獲得具有精確控制組成和微觀結構的人心臟組織成分，從毛細血管到整個器官，相關論文發(fā)表在《Science》上（EFL也分享解讀了這項開創(chuàng)性的工作，詳見文末“鏈接1”）。盡管FRESH打印取得的成果令人振奮，但這個過程仍然很慢，需要幾個小時才能制作出厘米級的組織。這樣使細胞暴露于次優(yōu)的培養(yǎng)環(huán)境中，導致細胞受到很大的應力，進而可能損害其功能。此外，緩慢的打印過程限制了這項技術的臨床轉化。

生物打印技術需要快速沉積各種類型的細胞和材料，以重建復雜的結構。Mohsen Akbari教授團隊采用多材料生物打印，同時或順序分配不同的材料和細胞以實現(xiàn)組織仿生。然而，緩慢的沉積速度和在打印頭之間切換所需的時間會顯著降低生物打印速度，同時將細胞長時間保持在非生理環(huán)境中將影響打印后的細胞功能。Ali Khademhosseini教授團隊使用一束毛細管構成的打印頭，通過數(shù)字控制含有不同生物墨水的打印頭之間的快速平滑切換和協(xié)同工作，制備了復雜的組織結構，提升了多材料生物打印的速度。長期以來，使用基于光的技術，例如數(shù)字光處理 (DLP)，進行多材料生物打印一直是一項重大的技術挑戰(zhàn)。在打印過程中更換生物墨水既費時又費力，并且會損壞結構和細胞。為了解決這個問題，Ali Khademhosseini教授團隊開發(fā)出一種多材料DLP生物打印機，利用計算機控制的微流體生物墨水注射裝置將不同的生物墨水快速流動到圖案光的路徑上，同時實現(xiàn)自動化生物墨水更換和清洗步驟，將打印速度提高了5倍。

2. 增強細胞活力
在具有臨床尺寸（厘米級）的組織中保持細胞活力和功能面臨著許多挑戰(zhàn)，包括大量的處理時間、施加于細胞的高剪切應力以及需要血管輸送氧氣與營養(yǎng)同時去除細胞廢物。

加利福尼亞大學伯克利分校Hayden K. Taylor團隊開發(fā)出高速“容積3D打印技術”，只要光照幾十秒，完美雕像浮出水面。相關論文發(fā)表在《Science》上（EFL也分享解讀了這項開創(chuàng)性的工作，詳見文末“鏈接1”）。受計算機斷層掃描原理的啟發(fā)，烏得勒支大學Riccardo Levato教授團隊使用體積打印在20秒內將載有類器官的明膠水凝膠塑造成復雜的厘米級 3D 結構（EFL也分享解讀了這項開創(chuàng)性的工作，詳見文末“鏈接2”）。到目前為止，體積生物打印技術還處于起步階段，這種方法需要大量的生物墨水和大量的細胞來打印大型組織。此外，當前的體積打印機僅限于打印一種生物墨水，這限制了其在模擬天然組織的多組分復雜性方面的應用。

打印方法和條件對細胞活力有很大影響。例如，基于擠壓的打印細胞在通過窄管時會受到很高的剪切應力。細胞受到的剪切應力與生物墨水粘度和打印速度成正比，與噴嘴直徑成反比。因此，任何提高打印速度和分辨率的努力都可能使細胞受到高剪切應力并降低細胞活力。反之，降低生物墨水粘度可以提高細胞活力，但會阻礙可打印性并導致支架機械性能不佳。為了解決此問題，Mohsen Akbari教授團隊使用同軸打印的方法，使細胞遠離剪切應力最高的通道壁，從而保護細胞免受粘性生物墨水帶來的流變剪切力。另一種策略是使用光學生物打印。因為這種方法不使用噴嘴進行打印，所以細胞不會受到破壞性的剪切力。

生物墨水的物理和化學特性對打印后細胞的活力和功能也至關重要�，F(xiàn)有生物墨水的一個普遍缺點是孔徑小，這會阻礙可溶性分子的對流轉運并阻礙細胞遷移和組織重塑。Griffin 等人使用顆粒材料制備支架用于皮膚組織快速再生，該生物墨水具有大表面體積比和短擴散路徑的優(yōu)點，增強了向細胞的營養(yǎng)輸送以及廢物的去除，促進了細胞的長期存活。此外，這些生物墨水的互連孔隙在支架降解之前促進細胞向內生長和組織重塑。Fang 等人使用具有不同尺寸和特性的微凝膠，制造出與天然組織結構相似的極其復雜的組織結構。事實上，顆粒狀生物墨水的廣泛應用需要它們能夠模擬天然組織的各向異性和分層結構。為此，具有非球形幾何形狀的微凝膠和 Janus 微�？捎糜谥圃祛w粒狀生物墨水。這可以與計算流體動力學和人工智能相結合，以最大限度地提高質量傳遞和細胞向內生長，同時保持生物打印組織的機械性能。

構建功能性組織的障礙之一是確保工程結構在制造后的長期生存。大自然通過形成一個多尺度的血管網(wǎng)絡完美地規(guī)避了這一挑戰(zhàn)，這些血管網(wǎng)絡在整個組織中相互交織。美國萊斯大學Jordan S. Miller與華盛頓大學Kelly R. Stevens合作，利用投影立體光刻（projection stereolithography）3D打印技術，制備出會“呼吸”的人工肺，只需數(shù)分鐘就可在透明光聚合水凝膠中制備具有3D內部功能結構的血管系統(tǒng)，相關論文發(fā)表在《Science》上，并被選為當期封面。（EFL也分享解讀了這項開創(chuàng)性的工作，詳見文末“鏈接1”）。盡管基于光的方法相對較慢，但可以一次生成多個組織——這一特征對于藥物篩選的高通量組織生產(chǎn)至關重要。

3. 展望
在過去的幾年里，生物打印在各個方面都取得了長足的進步。進一步提高生物打印分辨率，同時允許制造具有厘米級尺寸的臨床相關組織，是下一個重要的里程碑。然而，實現(xiàn)高分辨率需要較長的打印時間，并且會在打印過程中將細胞暴露在高剪切應力下，所有這些都可能會損壞細胞并損害打印后的細胞功能。因此，未來的努力應該集中在使生物打印組織在生理環(huán)境中保持高細胞活力的創(chuàng)新上。此外，使用數(shù)值模擬工具和機器學習方法對生物打印參數(shù)和生物墨水的生物物理和生化特性進行系統(tǒng)評估可以提高分辨率和組織模擬，同時保持細胞活力并最大限度地降低操作成本。

用于器官移植和再生醫(yī)學的具有臨床相關尺寸的生物打印組織需要數(shù)十億到數(shù)萬億個細胞，由此帶來了大批量細胞培養(yǎng)的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的平面培養(yǎng)系統(tǒng)無法大規(guī)模生產(chǎn)細胞。填充床培養(yǎng)系統(tǒng)和懸浮平臺可用于滿足生物打印大型組織的批量要求。然而，與擴增和分化培養(yǎng)基的高成本、污染以及用于大規(guī)模生產(chǎn)細胞的現(xiàn)有分化方案的優(yōu)化相關的挑戰(zhàn)仍然存在。因此，生物反應器設計的進步和新型微載體的開發(fā)能夠實現(xiàn)高產(chǎn)量的高密度細胞培養(yǎng)，這將極大地有利于組織打印領域。

用于器官移植的生物打印組織需要經(jīng)過嚴格的監(jiān)管程序，以確保其長期安全性和有效性。由于生物打印應用的多樣性，受到 FDA不同部門的監(jiān)管，因此為建立生物打印產(chǎn)品的質量標準制定通用指南可能具有挑戰(zhàn)性。與器官移植相比，用于疾病建模的生物打印面臨的監(jiān)管障礙更少。然而，生物打印疾病模型仍需要驗證，以確保正確模擬結果臨床轉化所需的病理生理學和藥代動力學特性（例如炎癥反應、代謝、分子轉運）、穩(wěn)健性和可重復性。

總體而言，生物打印技術的不斷更迭和廣泛應用，將極大地影響個性化醫(yī)療的發(fā)展。生物打印的未來應用也不局限于器官移植和疾病建模，還可以用于創(chuàng)建含有藻類或細菌的結構以生產(chǎn)可再生能源或捕獲二氧化碳，或者通過生產(chǎn)“人造肉”徹底改變食品行業(yè)。

文章來源：https://www.sciencedirect.com/sc ... i/S0092867422007206