甲殼素納米原纖維輔助3D打印全甲殼素水凝膠用于傷口敷料

來源：EngineeringForLife

3D打印技術(shù)中使用的直接墨水書寫技術(shù)通常應用于生物醫(yī)學水凝膠的設計。近期，武漢科技大學的段博團隊提出了一種通過直接墨水書寫技術(shù)制備用于傷口敷料的全甲殼素墨水的策略（圖1）。打印的支架顯示出均勻的微米級孔隙結(jié)構(gòu)和納米纖維編織網(wǎng)絡。由于甲殼素和立體空間骨架具有良好的生物相容性，該支架作為傷口敷料表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，可以促進細胞增殖、膠原沉積和傷口的血管生成，顯示出其在生物醫(yī)學應用中的潛力。

相關(guān)研究成果以“Chitin nanofibrils assisted 3D printing all-chitin hydrogels for wound dressing”為題于2024年3月6日發(fā)表在《Carbohydrate Polymers》上。

圖1 全甲殼素基3D打印油墨的設計

1. 3D打印甲殼素/MACNF油墨的表征
流變測試是表征直接油墨書寫（DIW）復合油墨性能的有效方法。首先研究了MACNF添加對甲殼素油墨的流變行為和可印刷性的影響。隨著剪切速率的增加，所有樣品的粘度都迅速降低，表明存在剪切稀化行為（圖2a）。圖2b顯示了儲能模量（G'）和損耗模量（G''）與振蕩應力的函數(shù)關(guān)系。最終選擇5 wt%、7.5 wt%和10 wt% MACNF的引入量進行3D打印。還測試了動態(tài)階躍應變掃描，模擬了整個3D打印過程（圖2c）。在1%和200%應變下連續(xù)進行3次掃描，分別模擬復合油墨的固態(tài)和流動狀態(tài)，每個循環(huán)持續(xù)100 s。

圖2 15 °C下測試的甲殼素/MACNF油墨的流變行為

2. 3D打印甲殼素/MACNF支架的納米纖維結(jié)構(gòu)和力學性能
選用甲殼素/5 wt% MACNF油墨作為例，所得支架保持了設計的形狀，而不會出現(xiàn)明顯的塌陷或變形（圖3a，b）。通過SEM仔細觀察支架的表面和橫截面（圖3c-f）。支架表面呈現(xiàn)出直徑均勻約330 μm的多糖細絲結(jié)構(gòu)，下層的細絲可以支撐上層細絲，從而承受重力。放大的照片顯示，支架的表面是一個均勻的納米纖維網(wǎng)絡，其中包括甲殼素納米纖維和MACNF（圖3g）。壓縮測試顯示MACNF的額外量對甲殼素水凝膠網(wǎng)絡有顯著影響，進而影響其力學性能（圖3h-i）?？傊?，甲殼素/5 wt% MACNF支架在印刷操作和應用中具有最佳的填料引入量和機械強度。

圖3 通過SEM和力學性能進行形態(tài)觀察

3. 3D打印甲殼素/MACNF水凝膠中的相互作用
隨后，研究者采用XRD、FT-IR和XPS研究了3D打印甲殼素/MACNF支架水凝膠中再生甲殼素與β-甲殼素納米纖維之間的相互作用。XRD顯示了甲殼素/MACNF的聚集狀態(tài)（圖4a-b），特征峰變化表明MACNF的引入在一定程度上阻礙了甲殼素分子鏈的自組裝和甲殼素晶體的形成。FT-IR和XPS表明，具有親水性羧基和豐富含氧基團的MACNF可以通過氫鍵與甲殼素分子鏈相互作用，從而調(diào)節(jié)甲殼素堿溶液的溶液性質(zhì)，使其復合油墨可印刷（圖4c-g）。

圖4 3D打印甲殼素/MACNF水凝膠中的相互作用

4. 細胞相容性和體內(nèi)傷口愈合
隨后，通過CCK-8和活死細胞染色評估了3D打印的全甲殼素基支架對小鼠成纖維細胞（L929）的基本細胞毒性。如圖5所示，在與薄膜和支架組共培養(yǎng)1、2和3天后，L929細胞顯示出健康趨勢。從CCK8測定來看，細胞活性可以達到>90%，這證明甲殼素/5 wt% MACNF墨水對L929細胞幾乎無毒。

圖5 細胞相容性試驗

為了進一步評估薄膜和支架的效果，在全層皮膚缺損傷口模型中研究了促進傷口愈合的能力。如圖6所示，隨著恢復時間的增加，小鼠的傷口逐漸閉合并減小。與對照組相比，薄膜和支架處理的傷口在3天后均有明顯的收縮，表明甲殼素水凝膠具有促進傷口愈合的作用。HE染色結(jié)果（圖7）表明，在顯微鏡下，薄膜和支架組的未愈合區(qū)域小于紗布組，均在一定程度上促進了傷口愈合。支架水凝膠更有效，這可能是由于微米級的孔隙結(jié)構(gòu)促進了氧氣交換以及過量滲出物的蒸發(fā)，為傷口愈合提供了更合適的環(huán)境。Masson染色表明，甲殼素可以通過促進傷口膠原沉積來加速傷口愈合，并且支架結(jié)構(gòu)比薄膜結(jié)構(gòu)具有更好的效果（圖8）。此外，使用CD31免疫組織化學染色對血管密度進行進一步定量，以顯示水凝膠在加速血管生成中的作用（圖9）。

圖6 傷口變化情況

圖7 傷口區(qū)域表皮再生傷口的HE染色圖像

圖8 Masson染色圖

圖9 CD31的免疫組織化學染色

綜上，本文成功構(gòu)建了一種高分辨率、高形狀保真度的全甲殼素基三維結(jié)構(gòu)。MACNF能夠作為增稠劑來調(diào)節(jié)油墨的流變特性。MACNF表面的親水性羧基和豐富的含氧基團不僅能使其穩(wěn)定分散在甲殼素溶液中，而且能與甲殼素分子鏈形成大量的氫鍵相互作用，參與甲殼素的自組裝和聚集過程，從而賦予混合油墨印刷適性。三維多孔支架具有合適的機械強度，對細胞活性幾乎沒有影響。在傷口上應用相同配方的流延膜和印刷支架時，甲殼素顯示出其優(yōu)異的生物相容性和生物活性，促進細胞增殖、膠原沉積和血管生成，最后促進傷口愈合。由于支架的微米級孔隙結(jié)構(gòu)，支架敷料下的傷口比薄膜敷料顯示出更快的愈合速度。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2024.122028