3小時(shí)打印窗口+自由基清除！《AM》報(bào)道3D打印水凝膠

來(lái)源：EngineeringForLife

3D生物打印作為組織工程與增材制造交叉領(lǐng)域的前沿技術(shù)，致力于構(gòu)建具有生物活性的功能化結(jié)構(gòu)。該技術(shù)通過(guò)將活細(xì)胞整合至生物墨水，結(jié)合精密沉積系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)具有高度幾何保真度的復(fù)雜組織構(gòu)建。其核心優(yōu)勢(shì)在于能夠逐層精準(zhǔn)沉積生物墨水，形成可植入組織或高仿真生物模型，目前已在皮膚、血管網(wǎng)絡(luò)、神經(jīng)組織、軟骨及骨骼模型等組織工程領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。3D生物打印技術(shù)架起了組織工程與增材制造之間的橋梁，但開(kāi)發(fā)兼具理想生物特性和物理性能的生物墨水仍面臨挑戰(zhàn)。透明質(zhì)酸（HA）因其優(yōu)異的生物相容性和細(xì)胞識(shí)別特性成為極具潛力的基材。

來(lái)自瑞典烏普薩拉大學(xué)的Oommen P. Varghese團(tuán)隊(duì)通過(guò)在半胱氨酸修飾的HA中引入動(dòng)態(tài)二硫鍵交聯(lián)機(jī)制，設(shè)計(jì)出能在生理pH條件下成膠的HA基生物墨水。針對(duì)二硫鍵交聯(lián)水凝膠固化速度慢的固有缺陷，創(chuàng)新性添加碘化鉀（KI）實(shí)現(xiàn)濃度依賴型凝膠加速——KI在維持水凝膠結(jié)構(gòu)完整性的同時(shí)，不僅顯著提升固化效率，還賦予材料自由基清除能力。當(dāng)KI濃度控制在50 mM時(shí)，墨水可獲得超過(guò)3小時(shí)的打印窗口期，既能保障細(xì)胞存活率，又可支持超細(xì)針頭（32G，內(nèi)徑108微米）打印作業(yè)，從而成功構(gòu)建出尺寸超過(guò)3厘米的復(fù)雜3D結(jié)構(gòu)。應(yīng)用該墨水構(gòu)建的骨關(guān)節(jié)炎疾病模型，首次揭示了人間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（hMSCs）對(duì)炎癥環(huán)境下軟骨細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。這項(xiàng)研究攻克了3D生物打印中的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸，為創(chuàng)新體外模型構(gòu)建提供了可靠平臺(tái)，對(duì)疾病建模和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展具有重要推動(dòng)作用。相關(guān)工作以題為“Ultra-Fine 3D Bioprinting of Dynamic Hyaluronic Acid Hydrogel for in Vitro Modeling”的文章發(fā)表在2025年05月13日的期刊《Advanced Materials》。

【半胱氨酸修飾透明質(zhì)酸水凝膠的合成與表征】
為開(kāi)發(fā)自交聯(lián)生物墨水，本文基于二硫鍵化學(xué)設(shè)計(jì)反應(yīng)體系——該反應(yīng)可在生理pH條件下進(jìn)行，但反應(yīng)速率有待提升。為此，本文合成了半胱氨酸修飾的透明質(zhì)酸（HA-Cys）。具體方法為：采用碳二亞胺偶聯(lián)化學(xué)，以N-羥基苯并三唑（HOBt）為親核催化劑，通過(guò)質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）優(yōu)化方案（圖1a），在pH 4.7條件下選擇性修飾酰肼末端，保留氨基游離狀態(tài)，最終獲得半胱氨酸修飾的生物聚合物。通過(guò)核磁氫譜中對(duì)應(yīng)次甲基（─CHNH₂，4.22 ppm）和亞甲基（─CH₂SH，2.76 ppm）的質(zhì)子信號(hào)驗(yàn)證修飾度，并采用Ellman法進(jìn)一步確認(rèn)化學(xué)修飾度為10%。該方法利用5,5'-二硫雙(2-硝基苯甲酸)（DTNB）的氧化性二硫鍵與游離巰基反應(yīng)，生成5-硫代-2-硝基苯甲酸（TNB）和混合二硫化物。該修飾度被證實(shí)為最優(yōu)值：過(guò)低會(huì)導(dǎo)致水凝膠強(qiáng)度不足，過(guò)高則可能改變細(xì)胞-材料相互作用。

圖1 透明質(zhì)酸（HA）修飾與水凝膠形成示意圖

【KI對(duì)HA-Cys水凝膠流變特性及抗氧化活性的影響】

為探究KI催化巰基氧化的作用機(jī)制，本文通過(guò)流變儀時(shí)間掃描測(cè)試分析了不同KI濃度下的凝膠動(dòng)力學(xué)。以儲(chǔ)能模量（G′）和損耗模量（G″）的交點(diǎn)作為凝膠點(diǎn)，標(biāo)志材料從流體行為轉(zhuǎn)變?yōu)閺椥阅�膠行為。如圖2a所示，KI濃度顯著影響凝膠動(dòng)力學(xué)：添加50 mM KI使HA-Cys溶液的凝膠時(shí)間從67.3分鐘縮短至11.7分鐘；當(dāng)KI濃度升至250 mM時(shí)，凝膠速度過(guò)快（<1分鐘）而無(wú)法通過(guò)流變測(cè)試捕捉（不同KI濃度下的G′/G″交點(diǎn)參見(jiàn)圖S2-S7）。這些數(shù)據(jù)明確證實(shí)：KI能在室溫及生理pH下氧化HA-Cys的游離巰基，且二硫鍵形成速率與KI濃度呈正相關(guān)。

通過(guò)振幅掃描測(cè)試進(jìn)一步評(píng)估KI對(duì)完全交聯(lián)水凝膠力學(xué)性能的影響。圖2b顯示，KI的添加并未顯著改變凝膠剛度，但250 mM KI組出現(xiàn)明顯軟化現(xiàn)象。具體而言，含25 mM KI的HA-Cys水凝膠G′為4005±504 Pa，而KI濃度提升至250 mM時(shí)，G′降至2455±684 Pa。這種力學(xué)性能下降源于高濃度KI導(dǎo)致的過(guò)快交聯(lián)——不均勻的快速交聯(lián)會(huì)降低網(wǎng)絡(luò)密度，這與我們前期研究結(jié)論一致：通過(guò)鹽類調(diào)節(jié)腙鍵/肟鍵交聯(lián)動(dòng)力學(xué)時(shí)，過(guò)快的凝膠速率會(huì)導(dǎo)致材料剛度下降。

圖2 碘化鉀（KI）對(duì)凝膠形成動(dòng)力學(xué)、流變特性及抗氧化活性的影響

【不同濃度KI的HA-Cys水凝膠細(xì)胞活性評(píng)估】

為評(píng)估不同濃度KI的HA-Cys生物相容性，本文進(jìn)行了活/死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)將人軟骨細(xì)胞封裝于具有最強(qiáng)清除活性的三種KI濃度（50、100和250 mM）HA-Cys水凝膠中，并以不含KI的HA-Cys作為對(duì)照組。圖3a展示了培養(yǎng)1天和3天后各水凝膠的活/死染色顯微圖像，其中綠色標(biāo)記活細(xì)胞，紅色標(biāo)記死細(xì)胞。通過(guò)ImageJ軟件計(jì)算活細(xì)胞占比（圖3b）發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)1天后所有水凝膠均保持高細(xì)胞活性（>90%）；培養(yǎng)3天后，不含KI與含50 mM KI的HA-Cys水凝膠仍保持>95%的高活性，而100 mM KI組活性降至≈88%，表明存在一定毒性；當(dāng)KI濃度升至250 mM時(shí)，細(xì)胞活性急劇下降至31%。

為驗(yàn)證上述結(jié)果，本文采用Presto Blue檢測(cè)評(píng)估細(xì)胞代謝活性。封裝1天后各組無(wú)顯著差異（圖3c），但在250 mM KI高濃度下，3天和7天后的代謝活性分別顯著降至39±15%和35±14%。值得注意的是，50和100 mM KI組在這些時(shí)間點(diǎn)未出現(xiàn)明顯代謝活性變化。為進(jìn)一步精確評(píng)估低于250 mM KI的細(xì)胞毒性，我們檢測(cè)了封裝4天后培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶（LDH）的釋放量（細(xì)胞損傷標(biāo)志物）。如預(yù)期所示，250 mM KI水凝膠毒性最高，而50 mM KI組的LDH釋放量最低（20.4%），甚至優(yōu)于100 mM KI組（33.8%）。綜合其低細(xì)胞毒性、優(yōu)異自由基清除能力和顯著加速凝膠形成的特性，本文最終選擇含50 mM KI的HA-Cys（HA-Cys.KI）作為最優(yōu)配方進(jìn)行后續(xù)分析。

圖3 不同濃度碘化鉀（KI）對(duì)封裝細(xì)胞活性的影響

【水凝膠在不同條件下的溶脹與穩(wěn)定性研究】

由于水凝膠的穩(wěn)定性和溶脹行為是設(shè)計(jì)生物墨水的關(guān)鍵參數(shù)，本文首先測(cè)定了37℃ PBS中水凝膠30天內(nèi)的溶脹率。令人欣慰的是，含KI與不含KI的兩種水凝膠溶脹程度有限——前6天僅溶脹10%（圖4a）。第9天時(shí)，HA-Cys和HA-Cys.KI的溶脹率分別增至18.8±4.6%和24.4±1.1%，第14天時(shí)進(jìn)一步達(dá)到37.4±9.9%與35.4±11.6%，此后在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)保持平衡狀態(tài)。

接下來(lái)本文評(píng)估了透明質(zhì)酸水凝膠的酶降解特性。已知HA在體內(nèi)普遍存在的透明質(zhì)酸酶作用下會(huì)發(fā)生降解，該酶能催化HA骨架中β-1→4糖苷鍵的斷裂。這種酶存在于皮膚、眼睛、肝臟、腎臟等多個(gè)器官以及血液、淚液等體液中，還能一定程度分解結(jié)締組織中的其他粘多糖。因此，本文在37℃富含透明質(zhì)酸酶的培養(yǎng)基中考察了含/不含KI的HA-Cys水凝膠穩(wěn)定性（酶濃度≈人血漿濃度的40倍）。以初始凝固時(shí)水凝膠質(zhì)量（零時(shí)間點(diǎn)）為100%基準(zhǔn)，監(jiān)測(cè)重量變化百分比。實(shí)驗(yàn)顯示，所有水凝膠在孵育前6小時(shí)均顯著溶脹，并在10天內(nèi)持續(xù)膨脹（圖4b），隨后進(jìn)入劣化階段，至第14天實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)完全崩解。兩種凝膠（HA-Cys與HA-Cys.KI）的降解曲線無(wú)顯著差異，表明添加50 mM KI不會(huì)影響水凝膠的穩(wěn)定性與降解特性。

圖4 碘化鉀（KI）在半胱氨酸修飾透明質(zhì)酸（HA-Cys）水凝膠中對(duì)穩(wěn)定性、剪切稀化和自修復(fù)性能的作用

【KI對(duì)HA-Cys水凝膠中干細(xì)胞行為的影響】

水凝膠基質(zhì)封裝細(xì)胞會(huì)顯著改變其力學(xué)性能和降解動(dòng)力學(xué)，這種變化源于細(xì)胞分泌的金屬蛋白酶和培養(yǎng)基中可溶性因子對(duì)生物聚合物穩(wěn)定性、交聯(lián)結(jié)構(gòu)及粘彈性的影響。為評(píng)估KI對(duì)hMSCs相容性的作用，本文進(jìn)行了活/死細(xì)胞染色。圖5a的共聚焦3D圖像顯示，兩種水凝膠中的細(xì)胞均呈現(xiàn)均勻分布且具有良好生物相容性。

通過(guò)封裝后1、3、7、14天的活/死細(xì)胞染色（圖5b）發(fā)現(xiàn)，各時(shí)間點(diǎn)兩種水凝膠均以綠色活細(xì)胞為主，證實(shí)50 mM KI的HA-Cys水凝膠具有良好生物安全性。定量分析顯示（圖5c），7天內(nèi)細(xì)胞存活率均超過(guò)90%，14天后輕微下降至略低于90%。細(xì)胞密度檢測(cè)（圖5d）表明：封裝首日，含KI與不含KI水凝膠的細(xì)胞數(shù)分別為507±44和493±74個(gè)/mm²，7天后降至≈320個(gè)/mm²，14天后減少超半數(shù)。這種動(dòng)態(tài)變化揭示了細(xì)胞與基質(zhì)間的生物活性互動(dòng)，以及hMSCs的漸進(jìn)釋放現(xiàn)象。

圖5 碘化鉀（KI）在半胱氨酸修飾透明質(zhì)酸（HA-Cys）水凝膠中對(duì)hMSCs行為及水凝膠降解的影響

【HA-Cys.KI水凝膠的3D打印潛力】

本研究的核心目標(biāo)是通過(guò)優(yōu)化凝膠動(dòng)力學(xué)時(shí)間窗來(lái)實(shí)現(xiàn)3D生物打印。為此，本文探索了HA-Cys.KI水凝膠作為生物墨水在干細(xì)胞遞送和體外模型構(gòu)建中的應(yīng)用。針對(duì)擠出式3D生物打印分辨率不足的固有局限，本文選用內(nèi)徑159 µm的30G針頭，根據(jù)水凝膠黏度將壓力設(shè)置為250 kPa，在pH調(diào)整后60、90、120、150及180分鐘分別打印10 mm×10 mm×1 mm的矩形棱柱模型（填充率40%）。通過(guò)Hoechst核染色熒光成像可見(jiàn)（圖6a），HA-Cys.KI水凝膠具有60-180分鐘的寬泛打印窗口，而純HA-Cys水凝膠因凝膠動(dòng)力學(xué)過(guò)慢無(wú)法滿足打印需求。

打印精度評(píng)估顯示（圖6b）：60分鐘時(shí)因黏度過(guò)低導(dǎo)致纖維流動(dòng)和邊緣圓鈍，形狀保真度不足設(shè)計(jì)的50%；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，150分鐘和180分鐘打印的結(jié)構(gòu)精度顯著提升（保真度分別達(dá)74±7%和86±4%），孔徑增大表明形狀保持能力增強(qiáng)。高倍熒光圖像（圖6c）揭示纖維尺寸隨時(shí)間遞減——60分鐘時(shí)約400 µm，180分鐘時(shí)降至200 µm（圖6d），這種與凝膠黏度正相關(guān)的特性確保了打印后結(jié)構(gòu)的均一性和細(xì)胞均勻分布。

圖6 含碘化鉀（KI）的半胱氨酸修飾透明質(zhì)酸（HA-Cys.KI）水凝膠的3D生物打印優(yōu)化

【超精密3D打印對(duì)軟骨細(xì)胞與hMSCs的影響研究】

為驗(yàn)證生物墨水通過(guò)細(xì)針注射輸送不同尺寸敏感人類細(xì)胞并保持其完整性的潛力，本文采用32G針頭進(jìn)行細(xì)胞注射。既往研究表明，細(xì)胞在通過(guò)注射針頭時(shí)會(huì)承受機(jī)械剪切力和拉伸力，可能導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷。當(dāng)細(xì)胞懸浮于生理鹽水或細(xì)胞培養(yǎng)基等低粘度溶液時(shí)，這種損傷效應(yīng)更為顯著。本實(shí)驗(yàn)選取尺寸較大（約20-50μm）的hMSCs和較小（約10-20μm）的人源軟骨細(xì)胞，經(jīng)熒光標(biāo)記后封裝于含50mM KI的HA-Cys水凝膠中。如圖7a所示，兩種細(xì)胞均能通過(guò)32G針頭成功打印，既可單獨(dú)打印也可在不同纖維中并行打印。細(xì)胞在打印纖維內(nèi)分布均勻，證實(shí)了載細(xì)胞水凝膠的均質(zhì)包封性和可打印性。

為評(píng)估水凝膠在擠出后維持細(xì)胞存活的效果，本文以常規(guī)培養(yǎng)基作為對(duì)照載體，在相同壓力條件下通過(guò)32G針頭進(jìn)行3D生物打印。采用比色法檢測(cè)LDH釋放量以量化細(xì)胞膜損傷程度。LDH釋放實(shí)驗(yàn)顯示（圖7b），hMSCs在兩組中均表現(xiàn)出比軟骨細(xì)胞更顯著的膜完整性損傷。總體而言，無(wú)論采用水凝膠還是培養(yǎng)基，hMSCs的存活率均低于軟骨細(xì)胞，這可能與其較大尺寸導(dǎo)致的膜易損性相關(guān)。但數(shù)據(jù)表明，水凝膠對(duì)兩種細(xì)胞的保護(hù)作用顯著優(yōu)于培養(yǎng)基：注射水凝膠時(shí)軟骨細(xì)胞存活率超過(guò)90%，而培養(yǎng)基組僅約50%；hMSCs的差異更為突出，水凝膠組存活率達(dá)52±6%，培養(yǎng)基組僅9±3%。這些發(fā)現(xiàn)印證了水凝膠在3D打印過(guò)程中對(duì)抗剪切損傷和失巢凋亡的優(yōu)越性能，與我們前期關(guān)于HA基生物墨水提升干細(xì)胞存活率的觀察結(jié)果一致。

圖7 兩種不同細(xì)胞類型的3D生物打印及打印過(guò)程對(duì)細(xì)胞活性的影響

【體外組織與疾病模型的3D生物打印】

具有高形狀保真度和精確細(xì)胞分布的3D打印組織模型，為開(kāi)發(fā)復(fù)雜且具有生物學(xué)相關(guān)性的體外模型提供了平臺(tái)，使研究者能夠在3D環(huán)境中深入探究細(xì)胞間相互作用。為此，本文研究了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）與軟骨細(xì)胞在3D打印體外模型中的遷移行為。實(shí)驗(yàn)中，我們將空心圓柱體（含細(xì)胞或不含細(xì)胞）直接打印于培養(yǎng)板中，隨后在其空心區(qū)域填充不含細(xì)胞或含細(xì)胞的水凝膠（圖8a）。為構(gòu)建不同細(xì)胞分布的3D模型，本文設(shè)計(jì)了三種方案：1）模型1：打印封裝軟骨細(xì)胞的空心圓柱凝膠，中心腔填充無(wú)細(xì)胞凝膠；2）模型2：先打印無(wú)細(xì)胞空心圓柱，中心腔填充含hMSCs的生物墨水；3）模型3：打印多細(xì)胞復(fù)合體——空心圓柱含軟骨細(xì)胞，中心腔填充含hMSCs的生物墨水。

盡管生物墨水中hMSCs與軟骨細(xì)胞的密度相同，但構(gòu)建模型所需的空心圓柱與中心腔體積存在差異。通過(guò)DiL（紅色）和DiO（綠色）熒光染料分別標(biāo)記hMSCs與軟骨細(xì)胞，我們追蹤了7天培養(yǎng)期內(nèi)細(xì)胞的實(shí)時(shí)遷移（圖8b）。結(jié)果顯示：模型1中，軟骨細(xì)胞在第2天開(kāi)始向中心遷移，第3天即填滿無(wú)細(xì)胞區(qū)域；模型2的hMSCs遷移延遲至第7天；模型3則呈現(xiàn)hMSCs在第5天向軟骨細(xì)胞的單向遷移，而軟骨細(xì)胞向hMSCs的遷移受限。ImageJ量化分析進(jìn)一步證實(shí)（圖8c），hMSCs的存在會(huì)抑制軟骨細(xì)胞遷移，但hMSCs自身受軟骨細(xì)胞趨化因子驅(qū)動(dòng)定向遷移——這與骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑膜中移植hMSCs向軟骨細(xì)胞遷移以促進(jìn)組織修復(fù)的臨床現(xiàn)象高度吻合。

圖8 體外模型的3D生物打印

【總結(jié)與展望】
本研究開(kāi)發(fā)了一種新型仿細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）生物墨水，通過(guò)半胱氨酸修飾透明質(zhì)酸（HA-Cys）的單組分體系，以KI為催化劑優(yōu)化凝膠動(dòng)力學(xué)，顯著提升了生物墨水的性能。這種二硫鍵交聯(lián)水凝膠具有精準(zhǔn)的凝膠動(dòng)力學(xué)、剪切稀化特性及打印后形狀保真能力，其雙重降解性（受封裝細(xì)胞類型與密度調(diào)控）進(jìn)一步增強(qiáng)了適用性。該單組分體系支持干細(xì)胞、癌細(xì)胞、免疫細(xì)胞等多細(xì)胞類型的可定制化封裝，為研究復(fù)雜細(xì)胞互作與疾病建模開(kāi)辟了新途徑。

參考資料：https://doi.org/10.1002/adma.202500315