加州大學生物3D打印GelMA基血管化皮膚

來源： EngineeringForLife

皮膚提供了一種生理屏障，可以保護內臟免受溫度變化、機械沖擊、各種微生物和化學物質的影響。它由三個主要成分組成:表皮，真皮和皮下組織。(1)表皮含有4 ~ 5層上皮細胞，可形成角質化的復層鱗狀上皮；(2)真皮由真皮成纖維細胞(DFs)產生的膠原和彈性蛋白纖維相互連接的網(wǎng)狀結構組成，真皮內的血液和淋巴管為皮膚提供營養(yǎng)，并與真皮成纖維細胞相互作用；(3)皮下組織血管分布良好，主要由脂肪、血管和神經組成。這些不同的皮層提供了獨特的微環(huán)境，其中每一層都可以直接或間接地與其他層溝通，從而實現(xiàn)其特殊功能。因此，擁有一個可復制的皮膚組織模型不僅有助于可靠地預測人類皮膚的功能反應，而且有可能在不久的將來開發(fā)出個性化的皮膚相關疾病模型。

近期，加州大學的Ali Khademhosseini教授團隊在Biofabrication雜志上發(fā)表的題為“Biofabrication of endothelial cell, dermal fibroblast, and multilayered keratinocyte layers for skin tissue engineering”的文章，作者使用基于生物醫(yī)學的方法和生物工程技術開發(fā)了一個具有內皮細胞網(wǎng)絡、真皮成纖維細胞和多層角質細胞的三維皮膚組織模型。

作者提出構建三維皮膚組織模型的思路：(1)在具有0.4μm孔徑的聚酯多孔膜上打印載有HUVECs的GelMA/海藻酸鹽水凝膠，該結構有利于真皮成纖維細胞與內皮細胞的相互作用以及促進營養(yǎng)物的擴散(形成內部血管網(wǎng)絡)；(2)打印封裝有人真皮成纖維細胞的GelMA水凝膠，通過調節(jié)基質硬度影響細胞的生長和功能；(3)通過多次在真皮層上方鋪覆包裹有角質細胞的明膠形成多層的表皮明膠涂層。

圖1 皮膚組織每層結構的示意圖

為了實現(xiàn)上述構想，作者首先將具有生物相容性的GelMA/海藻酸鹽水凝膠混合HUVECs并3D打印到多孔膜上，并檢測生物墨水的可打印性、凝膠性和對細胞活力的影響，并確定了合適的GelMA/海藻酸鹽水凝膠配比。

圖2 3D打印內皮細胞層

然后，在室溫下通過流變性測試和模量測試測量光交聯(lián)前后不同生物墨水的粘度和壓縮模量。實驗結果表明，隨著海藻酸鹽濃度的增加，交聯(lián)生物墨水的流變性能和壓縮模量變大。隨后，為了檢驗3D生物墨水的生物相容性，在培養(yǎng)的第1、4、7天對HUVECs的存活率進行了評估。細胞培養(yǎng)在柔軟的水凝膠中時表現(xiàn)出了更高水平的生存能力?；谏鲜鼋Y果，7.5% GelMA/2%海藻酸配方被選為HUVECs生物打印的生物墨水。

圖3 GelMA基水凝膠的粘性、壓縮模量和生物兼容性測試

由于基質硬度在調節(jié)細胞功能中起著關鍵作用，作者分別評估了5%、7.5%和10% GelMA水凝膠的流變性能、壓縮模量和人真皮成纖維細胞的生存能力，以確定設計真皮層的最佳凝膠濃度。結果表明，凝膠的流變模量和壓縮模量隨著凝膠濃度的增加而增加，而無論凝膠的濃度如何均顯示出良好的生物相容性。

圖4 機械性能可調節(jié)的GelMA水凝膠用于構建3D真皮層

之后，作者發(fā)現(xiàn)在濃度為7.5%的GelMA水凝膠中人真皮成纖維細胞具有更高的增殖和擴散能力。此外，在濃度為7.5%的GelMA水凝膠中人真皮成纖維細胞具有更高的I型膠原酶原的分泌能力和更低的I型金屬蛋白酶的分泌能力，表明該環(huán)境下人真皮成纖維細胞能形成更具有彈性和強度的皮膚組織。

圖5 真皮層細胞活性及功能鑒定

最后，作者將人角質細胞接種于真皮層上，然后將含1%的生長培養(yǎng)基的明膠覆蓋在角質細胞上并重復多次。結果表明，每層的人角質細胞都具有很高的存活能力，通過該方法可以在短時間內簡單地得到約137μm厚的表皮層。

圖6 多層角質細胞構建表皮層

為了可視化皮膚模型中不同的細胞層，作者在細胞播種前分別用藍、紅、綠對HUVECs、人真皮成纖維細胞和人角質細胞進行了標記。橫切面圖像顯示，構建的皮膚組織在每一層表現(xiàn)出良好的層次結構。在本研究中，作者提供了一種簡單的方法，利用生物醫(yī)學方法和生物工程技術來優(yōu)化皮膚組織的每一層。構建出的3D皮膚組織作為一個多功能平臺，使體外皮膚模型的重建成為可能。

圖7 3D生物制造皮膚組織模型