近場直寫打印水凝膠復(fù)合結(jié)構(gòu)：用于分層誘導(dǎo)功能性軟骨再生

盡管骨軟骨組織工程取得了重大進展，但要成功地重建具有不同空間組成、結(jié)構(gòu)和功能特性的三維類似本源的復(fù)雜組織仍是一個挑戰(zhàn)。上海交通大學戴尅戎院士團隊受細胞外基質(zhì)(ECM)組成的梯度和原生骨軟骨組織中的膠原纖維結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，設(shè)計并利用近場直寫技術(shù)制造了三層：淺表軟骨（S），深軟骨(D)，和軟骨下骨(B)的PCEC分層支架，并在其中填充含有間充質(zhì)干細胞(MSC)的甲基丙烯酰胺(GelMA)水凝膠與區(qū)域特異性生長因子。復(fù)合支架在體內(nèi)同時實現(xiàn)軟骨和軟骨下骨再生，證明仿生構(gòu)建模擬自然骨軟骨組織的空間變化，并以增強骨軟骨組織再生的可行性，相關(guān)研究成果“Bioinspired stratified electrowritten fiber-reinforced hydrogel constructs with layer-specific induction capacity for functional osteochondral regeneration”發(fā)表于Biomaterials上。

S\D\B的支架使用熔融近場直寫技術(shù)制造，其中B層不施加電壓，用不同的打印參數(shù)實現(xiàn)纖維的排列與直徑分布區(qū)別。載細胞的GelMA水凝膠使用紫外線輔助、逐步滲透并交聯(lián)，如Figure 1。層特異性纖維排列和生長因子傳遞的聯(lián)合作用使層特異性誘導(dǎo)BMSCs表現(xiàn)出與原生骨軟骨組織相似的分區(qū)細胞表型和ECM組成。此外，S層的加入可以使再生軟骨具有更潤滑和更耐磨的表面，這對功能性骨軟骨再生至關(guān)重要。

圖1 異質(zhì)復(fù)合結(jié)構(gòu)示意圖

異質(zhì)復(fù)合支架的實際打印結(jié)果如Figure 2。在PCEC-nHA 支架表面可以觀察到少量分散的HA顆粒，這表明HA納米顆粒已經(jīng)成功地融入到PCEC支架中。此外，載生長因子的微球和水凝膠中BMP-7、TGF- mik1和BMP-2的累積釋放譜顯示，GFs可以在3周的孵育時間內(nèi)持續(xù)釋放。

圖2 支架打印結(jié)果，支架力學與細胞生長狀態(tài)

不同的支架結(jié)構(gòu)在體外構(gòu)建S、D和B層，誘導(dǎo)軟骨形成和成骨相關(guān)的分區(qū)標記的差異表達，結(jié)果如Figure 3。 由于高模量PCEC纖維的增強，本來弱的GelMA水凝膠得到了增強，其壓縮模量與天然軟骨相當。結(jié)果表明mRNA和蛋白表達水平等級具有明顯不同，S + G + F組合后的樣品誘導(dǎo)帶顯性標記表達的能力顯著增強。

圖3 不同的支架配方在體外構(gòu)建S、D和B層，誘導(dǎo)軟骨形成和成骨相關(guān)的分區(qū)標記的差異表達

Figure 4顯示了三層S +G + F結(jié)構(gòu)的分區(qū)特異性軟骨形成和成骨相關(guān)標記蛋白積累和細胞F-肌動蛋白定向。結(jié)果表明，開發(fā)的三層S + G + F結(jié)構(gòu)可能有希望用于工程空間分層的骨-軟骨組織，具有原生細胞定向和帶狀標記蛋白沉積。

圖4 使用S + G + F構(gòu)建的三層結(jié)構(gòu)使細胞的空間分層定向和區(qū)域標記蛋白在體外積累

研究人員將先前實驗中表現(xiàn)最好的S + G + F組合支架用于兔骨-軟骨缺損模型的修復(fù)，如Figure 5。使用單層B、雙層B + D和三層B + D + S復(fù)合支架進行術(shù)后24周缺陷修復(fù)的大體觀察。結(jié)果表明，在缺陷區(qū)域引入S層能夠提供潤滑，減輕關(guān)節(jié)磨損，并使再生軟骨具有光滑的表面。所有被測組在術(shù)后6個月的缺損區(qū)域顯示出相當數(shù)量的鈣化組織。此外，隨著愈合時間的延長，可以觀察到骨沉積增強和支架逐漸降解的情況。

圖5 體外造軟骨成骨效果最好的復(fù)合結(jié)構(gòu)組合(S + G + F組合支架)在兔骨-軟骨缺損模型中的研究結(jié)果

綜上，在纖維引導(dǎo)和GF誘導(dǎo)的共同作用下，復(fù)合結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出良好的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向軟骨分化和成骨系分化的能力，并表現(xiàn)出具有空間變化的細胞表型和ECM組成的帶狀組織三維結(jié)構(gòu)。體內(nèi)軟骨缺損修復(fù)實驗進一步證實，纖維增強和生長因子加載的三層水凝膠結(jié)構(gòu)可以同時促進軟骨和軟骨下骨的再生。

論文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.120385