上海硅酸鹽所吳成鐵團隊《AM》：3D打印預神經化支架促進心肌修復

來源：EngineeringForLife

心肌梗死是一種常見的心血管疾病，目前的臨床治療方法在修復受損心肌組織方面效果有限。神經調節(jié)策略為心肌修復提供了新的思路，但現(xiàn)有方法如迷走神經刺激和藥理激活面臨著刺激信號控制和藥物副作用等挑戰(zhàn)。

近日，來自中國科學院上海硅酸鹽研究所的吳成鐵團隊開發(fā)了一種基于無機生物材料誘導的“預神經化”支架，以促進心肌梗死的修復。該支架不僅能促進神經干細胞分化為成熟神經元，還能通過神經調節(jié)作用增強心肌細胞的成熟和同步收縮，最終促進心肌組織的修復和心臟功能的恢復。

相關研究成果以“Inorganic Biomaterials Inducing Scaffolds Pre-Neuralization for Infarcted Myocardium Repair”為題于2025年5月24日發(fā)表在《Advanced Materials》上。

方案1 前神經化支架的設計和制備及其在梗死心肌修復中的應用示意圖

1.3D打印含SS支架的制備與表征
作者首先描述了含鍶硅酸鹽（SS）微粒的3D打印支架的制備和表征過程。SEM觀察到SS微粒呈現(xiàn)六方柱狀形態(tài)（圖1a），XRD確認其相與SrSiO3匹配（圖1b）。將不同濃度的SS微粒（0%、2%、5%、10%）與明膠甲基丙烯�；�（GelMA）基質混合，制備出一系列生物墨水，并利用流變學分析發(fā)現(xiàn)這些生物墨水在溫度敏感性、剪切變稀性能和屈服應力方面沒有顯著差異。隨后，通過3D生物打印機將這些生物墨水打印成網(wǎng)格狀支架（圖1c），SEM圖像顯示了支架的多孔結構，且SS微粒在GelMA基質中分布均勻（圖1d和圖1e）。此外，作者還測定了不同濃度SS微粒的支架在培養(yǎng)14天內的Sr和Si離子釋放情況（圖1f和圖1g），發(fā)現(xiàn)含2%和5% SS微粒的支架在培養(yǎng)7天后離子釋放基本穩(wěn)定。

圖1 硅酸鍶（SS）微粒和生物3D打印支架的表征

2.體外的預神經化行為
作者接著，作者探究了含鍶硅酸鹽（SS）微粒的3D支架在體外的預神經化行為。含SS微粒的支架（2%至10%濃度）對NSCs活性無明顯毒性，并且促進了NSCs的增殖，尤其是5SS-GelMA-NSC組表現(xiàn)出最高的增殖活性（圖2a-b）。5SS-GelMA-NSC支架在培養(yǎng)7天后顯著促進了NSCs向神經元的分化，同時降低了膠質細胞標記物GFAP的表達。隨著培養(yǎng)時間延長至10天和14天，神經相關基因的表達有所下降，但GFAP表達增加，表明7天是理想的預神經化時間（圖2c, 圖2d-f）。RT-qPCR結果顯示，5SS-GelMA-NSC支架在培養(yǎng)7天后，與神經元分化相關的基因（如Tuj1和MAP2）表達顯著高于對照組，而膠質細胞相關基因（GFAP）表達較低（圖2c）。免疫熒光染色直觀地顯示了5SS-GelMA-NSC組中Tuj1+神經元的比例高于對照組（圖2g-i）。

圖2 SS微粒誘導3D生物打印神經干細胞支架的神經元分化行為

3.神經化潛在機制探索
接著，作者探討了鍶硅酸鹽（SS）微粒對神經干細胞（NSCs）預神經化效應的潛在機制。對在5SS-GelMA-NSC支架和對照組GelMA-NSC支架中培養(yǎng)7天的NSCs進行了轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，5SS-GelMA-NSC組中有322個基因上調，123個基因下調�；�因本體（GO）分析顯示上調基因主要與髓鞘和軸突相關，京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析揭示了兩組在鞘脂代謝和軸突引導方面存在顯著差異（圖3a-b）。此外，還通過將NSCs與不同濃度的SS微粒提取液共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)500 μg mL⁻¹的SS提取液對NSCs具有毒性，而125 μg mL⁻¹的SS提取液（SS-125）能顯著促進NSCs向神經元分化和成熟（圖3c–f，圖3g–i）。這表明SS微粒釋放的Sr和Si離子是促進NSCs預神經化的重要因素。

圖3 硅酸鍶促進神經干細胞向神經元分化的機制及SS微粒提取液對神經干細胞神經元分化行為的影響

4.預神經化支架對體外心肌構建體的影響
接著，作者進一步分析了預神經化支架對體外心肌構建體（CMS）的影響。通過3D打印技術制備了含心肌細胞的支架（CMS），并與預神經化支架共培養(yǎng)，評估了預神經化支架對心肌細胞結構和功能的促進作用。與單獨培養(yǎng)的CMS相比，與5SS-GelMA-NSC預神經化支架共培養(yǎng)的CMS（CMS-co-5SS-NSCS）展現(xiàn)出最強的收縮行為（圖4a）。CMS-co-5SS-NSCS組顯示出良好的鈣信號同步性，表明心肌細胞之間的電信號傳遞更為協(xié)調。免疫熒光染色顯示CMS-co-5SS-NSCS組中Cx43表達水平較高，解釋了心肌細胞收縮的良好同步性（圖4b-c）。同時，α-actinin的廣泛分布和明顯的肌節(jié)形態(tài)表明心肌較為成熟。CMS-co-5SS-NSCS組中與縫隙連接相關的Gja1（Cx43）、鈣信號調節(jié)相關的Cacna1a以及心肌收縮相關參數(shù)Myh6/Myh7的表達水平較高，顯示出心肌細胞的成熟度（圖4d–f）。綜上，預神經化支架在體外對心肌修復具有良好的促進作用。

圖4 3D打印心肌細胞負載支架（CMS）與NSC-loaded支架體外共培養(yǎng)的心肌細胞活性表征

5.預神經化支架對心肌梗死（MI）大鼠模型心功能重建的影響
最后，作者分析了預神經化支架對心肌梗死（MI）大鼠模型心功能重建的影響。將預神經化支架（5SS-GelMA-NSC組）和對照支架（GelMA-NSC組）分別移植到MI大鼠的心臟表面，通過超聲心動圖評估心臟功能。結果顯示，與未移植支架的MI組相比，移植預神經化支架的大鼠在術后4周的心臟收縮力顯著提高，左心室縮短分數(shù)（FS）和射血分數(shù)（EF）均有所改善，而左心室內徑收縮末期（LVIDs）和舒張末期（LVIDd）的長度則有所減�。▓D5a-b）。與GelMA-NSC組相比，5SS-GelMA-NSC組的大鼠在這些心臟功能參數(shù)上表現(xiàn)出更顯著的恢復（圖5c-d）。上述結果表明預神經化支架能夠有效促進心肌梗死后的功能恢復。

圖5 支架移植后大鼠心功能的變化

6.預神經化支架在體內對心肌損傷的修復效果
將預神經化支架移植到心肌梗死（MI）大鼠模型的心臟表面，通過多種組織學和免疫熒光染色方法對心肌組織進行分析。Masson三色染色顯示，預神經化支架組的大鼠心肌梗死區(qū)域比例最低，左心室壁厚度最高（圖6a-c），表明該支架有助于心室重塑。小麥胚凝集素（WGA）染色顯示，預神經化支架顯著減輕了心肌細胞的代償性肥大（圖6d-e）。免疫熒光染色結果顯示，預神經化支架增加了心肌組織中縫隙連接蛋白Cx43和肌節(jié)蛋白α-actinin的表達，并促進了血管再生，表現(xiàn)為微血管（vWF+）和動脈（vWF+/α-SMA+）密度的增加（圖6f-k）。這些結果表明，預神經化支架在體內能有效修復梗死心肌，改善心室重塑，促進心肌組織再生和血管再生。

圖6 支架移植后第4周大鼠心臟梗死面積的表征

最后，作者研究了預神經化支架修復心肌梗死（MI）的潛在機制。作者對MI組、GelMA-NSC組和5SS-GelMA-NSC組大鼠的心肌組織進行了轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)5SS-GelMA-NSC組與GelMA-NSC組及MI組相比，差異表達基因（DEGs）顯著增加。基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析顯示，這些基因主要與生物鐘相關（圖7a-b）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，5SS-GelMA-NSC組中Per2、Per1、Usp2和Ciart這四個生物鐘基因的表達水平顯著高于其他兩組（圖7c）。實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）和免疫熒光染色結果也證實了這些基因在5SS-GelMA-NSC組中的高表達（圖7d–g, 圖7h–i）。這些基因在調節(jié)炎癥反應、抑制心肌損傷和促進血管再生方面具有重要作用，從而加速心肌梗死的修復。

圖7 預神經化支架促進心肌修復的機制及晝夜節(jié)律相關基因和蛋白表達的研究

綜上，本文開發(fā)了一種基于鍶硅酸鹽（SrSiO₃）微粒的預神經化支架，該支架可有效地促進神經干細胞分化為成熟神經元，并通過激活心肌組織中與生物鐘相關的基因（如Per2、Per1、Usp2和Ciart），顯著增強了心肌梗死后的心肌修復和心臟功能恢復。這一創(chuàng)新策略不僅改善了心肌細胞的成熟和同步收縮，還促進了心肌組織的再生和血管重建，為心肌梗死的治療提供了新的視角和潛在的臨床應用前景。

參考資料：
https://doi.org/10.1002/adma.202419765