絲素蛋白水凝膠的凝膠動(dòng)力學(xué)、形成機(jī)制、功能化及 3D 生物打印在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

來源：EFL生物3D打印與生物制造

絲素蛋白（SF）源自蠶繭纖維，具有生物相容性、可降解性和可持續(xù)性，其可加工成多種材料形式，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，其中絲素蛋白水凝膠因可通過調(diào)控凝膠過程實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)和性能的定制，在組織工程等領(lǐng)域頗具價(jià)值。然而，絲素蛋白水凝膠存在凝膠速度慢和生物惰性等限制其應(yīng)用的問題。來自迪肯大學(xué)的Jing-Liang Li教授、墨爾本大學(xué)的David R. Nisbet教授以及Linpeng Fan團(tuán)隊(duì)綜述了絲素蛋白水凝膠的形成、凝膠機(jī)制、動(dòng)態(tài)控制和功能化等研究領(lǐng)域進(jìn)展，從分子組裝和結(jié)晶的角度深入探討了調(diào)控絲素蛋白凝膠動(dòng)力學(xué)的策略和機(jī)制，還介紹了功能化途徑及3D打印絲素蛋白水凝膠的實(shí)際案例以說明這些策略、機(jī)制和途徑的具體應(yīng)用。相關(guān)工作以“Gelation Dynamics, Formation Mechanism, Functionalization, and 3D Bioprinting of Silk Fibroin Hydrogel Materials for Biomedical Applications”為題發(fā)表在《ACS Nano》上。

圖 1. 絲素水凝膠形成過程與應(yīng)用之間的關(guān)系。

研究內(nèi)容
1. 絲纖維和絲素蛋白結(jié)構(gòu)示意圖，通過掃描電鏡觀察、氨基酸序列分析及分子動(dòng)力學(xué)模擬，研究了天然蠶絲纖維及絲素蛋白（SF）的多層次結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，蠶絲纖維由兩根包裹絲膠的SF長絲組成，單根長絲由納米原纖束構(gòu)成；SF分子含重鏈（~391 kDa）、輕鏈（~25 kDa）和糖蛋白（~30 kDa），重鏈中甘氨酸（45.9%）、丙氨酸（30.3%）等形成的重復(fù)序列模塊（如GAGAGS、GAGAGY）通過氫鍵驅(qū)動(dòng)β-折疊結(jié)晶區(qū)形成，疏水區(qū)模塊（i、ii）與親水區(qū)模塊（iv）的協(xié)同作用決定了分子組裝行為。   

圖2. 絲纖維和絲素蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。   

2. 絲素蛋白水凝膠通過分子組裝和結(jié)晶過程的形成示意圖，利用時(shí)間分辨圓二色光譜（CD）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）及透射電鏡（TEM），研究了SF水凝膠的凝膠化機(jī)制。結(jié)果表明，凝膠化過程分為“成核-生長-網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定”三階段：SF分子先自組裝形成β-折疊晶核，隨后晶核生長為納米纖維并分支形成單域纖維網(wǎng)絡(luò)，最終通過氫鍵、疏水作用和靜電作用交聯(lián)成三維凝膠；凝膠動(dòng)力學(xué)受SF濃度（如7.2 wt% SF凝膠時(shí)間比0.6 wt%縮短7天）和分子量調(diào)控，高濃度或高分子量加速β-折疊聚集。   

圖3. 絲素蛋白水凝膠通過分子組裝和結(jié)晶過程的形成示意圖。   

3. 調(diào)節(jié)絲素蛋白水凝膠凝膠動(dòng)力學(xué)的方法示意圖，采用溶液化學(xué)調(diào)控（pH、離子強(qiáng)度、添加劑）、物理刺激（超聲、渦旋）及界面工程，研究了加速SF凝膠化的關(guān)鍵策略。結(jié)果表明：① pH調(diào)節(jié)至等電點(diǎn)（3.8-3.9）時(shí)，電荷中和使凝膠時(shí)間縮短至數(shù)小時(shí)；② 陽離子表面活性劑（如SDS，8-12 mM）通過靜電屏蔽和疏水誘導(dǎo)，將凝膠時(shí)間從8天縮短至15-18分鐘；③ 超聲處理（20-30秒）通過破壞分子內(nèi)氫鍵促進(jìn)β-折疊形成，使凝膠時(shí)間降至分鐘級，但高能量超聲可能損傷細(xì)胞；④ 二元溶劑（如正丁醇）通過脫水作用加速分子聚集，10%正丁醇可使凝膠時(shí)間縮短至39.6分鐘。   

圖4. 調(diào)節(jié)絲素蛋白水凝膠凝膠動(dòng)力學(xué)的方法示意圖。   

4. 絲素蛋白的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變和凝膠化機(jī)制示意圖，結(jié)合酶催化（辣根過氧化物酶/過氧化氫體系）、光引發(fā)聚合（甲基丙烯�；疭F）及動(dòng)態(tài)流變學(xué)測試，研究了化學(xué)交聯(lián)對凝膠動(dòng)力學(xué)和機(jī)械性能的影響。結(jié)果表明：① 酶催化氧化酪氨酸殘基形成二酪氨酸交聯(lián)，凝膠時(shí)間可控制在分鐘級，且交聯(lián)密度影響儲能模量（G'）；② 光引發(fā)交聯(lián)（UV照射365 nm）使甲基丙烯�；疭F在10分鐘內(nèi)形成穩(wěn)定水凝膠，打印結(jié)構(gòu)（如仿生氣管）的壓縮模量達(dá)11.55 MPa；③ 動(dòng)態(tài)共價(jià)交聯(lián)（如 Genipin）結(jié)合β-折疊結(jié)晶，可同步提升凝膠強(qiáng)度和生物相容性。   

圖5. 絲素蛋白的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變和凝膠化機(jī)制示意圖。   

5. 基于絲素蛋白生物墨水可調(diào)凝膠過程制備絲綢支架的3D打印系統(tǒng)示意圖，通過數(shù)字光處理（DLP）、擠出式生物打印及原位交聯(lián)技術(shù)，研究了SF生物墨水在復(fù)雜結(jié)構(gòu)制造中的應(yīng)用。結(jié)果表明：① DLP技術(shù)利用甲基丙烯�；疭F光交聯(lián)，可打印分辨率達(dá)100 μm的血管網(wǎng)絡(luò)和心臟模型，支持軟骨細(xì)胞黏附與分化；② 擠出式打印結(jié)合鈣離子觸發(fā)交聯(lián)，可制造含梯度孔隙的骨組織工程支架，與生物玻璃復(fù)合后促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化；③ 原位打印系統(tǒng)（如FRESH技術(shù)）通過可逆嵌入懸浮水凝膠，實(shí)現(xiàn)低黏度SF墨水（10% w/w）的3D結(jié)構(gòu)成型，細(xì)胞存活率超90%。   

圖8. 基于絲素蛋白生物墨水可調(diào)凝膠過程制備絲綢支架的3D打印系統(tǒng)示意圖。   

6. 用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的絲素蛋白生物墨水3D打印分層結(jié)構(gòu)示意圖，借助細(xì)胞共培養(yǎng)、體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)及免疫熒光染色，研究了3D打印SF支架的生物醫(yī)學(xué)性能。結(jié)果表明：① 打印的仿生氣管植入兔模型后，軟骨缺損處可見新生組織形成，II型膠原表達(dá)顯著增加；② 含RGD肽修飾的SF水凝膠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，體內(nèi)誘導(dǎo)毛細(xì)血管生成；③ 負(fù)載抗腫瘤藥物的SF納米顆粒復(fù)合水凝膠，可抑制小鼠皮下肝癌腫瘤生長，CD44+ CD133+腫瘤細(xì)胞減少60%以上。   

圖9. 用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的絲素蛋白生物墨水3D打印分層結(jié)構(gòu)示意圖。

研究結(jié)論
本研究聚焦于絲素蛋白水凝膠，全面綜述其形成、凝膠機(jī)制、動(dòng)態(tài)控制及功能化。研究發(fā)現(xiàn)，絲素蛋白的分子結(jié)構(gòu)（如重鏈重復(fù)序列和疏水區(qū)）是凝膠化和功能化的基礎(chǔ)，其凝膠過程通過分子組裝和結(jié)晶實(shí)現(xiàn)，可通過調(diào)節(jié)濃度、pH、離子、表面活性劑等加速凝膠動(dòng)力學(xué)。功能化策略包括化學(xué)修飾、納米粒子添加和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予水凝膠抗菌、促細(xì)胞黏附等特性。3D生物打印技術(shù)結(jié)合動(dòng)態(tài)凝膠控制，成功制備復(fù)雜仿生結(jié)構(gòu)，用于軟骨、骨組織再生等領(lǐng)域。盡管絲素蛋白水凝膠在生物相容性和可調(diào)控性上優(yōu)勢顯著，但其批次間分子量差異、規(guī)�；�生產(chǎn)及體內(nèi)安全性仍需進(jìn)一步研究，未來發(fā)展方向包括智能化功能整合與精準(zhǔn)生物制造。

文章來源：
https://doi.org/10.1021/acsnano.4c18568