哈佛醫(yī)學院Yu Shrike Zhang組綜述 | 4D生物材料的生物醫(yī)學應用

​近期，來自哈佛大學醫(yī)學院Yu Shrike Zhang教授課題組在Adcanced Healthcare Materials發(fā)表了綜述文章題為“Engineering (Bio)Materials through Shrinkage and Expansion”，文章全面的總結了可膨脹與可收縮的生物工程材料（4D材料）的變化機制，并且描述了兩類材料在生物醫(yī)學領域的應用場景，極具啟發(fā)意義。

文章簡介

在準確重現(xiàn)生物組織方面，生物醫(yī)學工程領域的研究人員長期以來一直難以攻克的兩大難點：細胞的復雜性和結構的復雜性。

細胞的復雜性難題可以通過使用干細胞來解決，干細胞可以分化為具有所需功能的體細胞。

至于結構的復雜性，人們對 2D 和 3D 微環(huán)境之間的細胞重塑差異的認識有所提高。研究表明，3D 微環(huán)境可以提供更多生理相關條件來指導細胞行為和調節(jié)細胞功能。因此，許多模擬組織的功能性 3D 結構已經通過一系列的解決方案被制造出來，例如生物3D打印技術。

然而，關于制造宏觀尺度或納米尺度結構的不確定性仍然存在，尤其是多尺度或分層結構。這可能是一個需要克服的關鍵障礙，因為從宏觀尺度到納米尺度的這種變化可能是在不同維度區(qū)域發(fā)展組織功能的決定性因素。

因此，控制跨多個尺度的工程支架的特定結構在形成目標組織的生物學功能方面起著至關重要的作用。與其他制造技術相比，生物3D打印在精確控制構造物體的結構特征方面表現(xiàn)出卓越的優(yōu)勢。

然而，由于生物材料和制造技術的限制，仿生支架固有的異質性很難用上述方法直接制造。可收縮和可膨脹材料的最新進展可以改變網絡間距，從而導致尺寸或形狀發(fā)生變化，通過提供尺寸或形狀控制的補充策略，進一步有效地擴展了生物3D打印制造技術的潛力。

這篇文章中，我們首先從材料科學的角度詳細總結了可收縮或可膨脹材料的最具代表性的機制。然后，我們闡明了由于 pH、溫度、溶脹、靜電相互作用、納米顆粒或后交聯(lián)引起的尺寸/形狀變化的最先進設計策略。此后，我們重點介紹了由材料收縮和膨脹實現(xiàn)的代表性生物醫(yī)學應用，重點是通過生物3D打印技術策略制造的那些應用。然后，提出了對未來前景的展望，將這一原則擴展到其他有前景的領域。

溫度：

作為外部刺激因素之一，溫度可能是材料尺寸/形狀變化的最廣泛使用的刺激，因為它易于控制。關于材料相變的一個重要概念稱為臨界溶解溫度。當材料在該臨界溶解溫度以上從可溶狀態(tài)轉變?yōu)椴豢扇軤顟B(tài)時，它被定義為下臨界溶解溫度 (LCST)，而相比之下，上臨界溶解溫度 (UCST) 的特征在于：相變以相反的方式發(fā)生，即當溫度高于 LCST 時材料不溶，而在低溫（低于 LCST）時變?yōu)榭扇堋?/font>

溫度響應材料的膨脹或收縮是這種可逆相變的結果。

pH值：

pH 值刺激水凝膠是可收縮和可膨脹系列的另一個主要分支。機制與水凝膠網絡中側基的性質有關，當周圍環(huán)境的 pH 值發(fā)生變化時，水凝膠網絡中的側基可以被電離并重新平衡水凝膠內帶電離子的密度。其次是離子重新分布，具有相同電荷的相鄰水凝膠骨架之間靜電排斥的改變導致水凝膠膨脹或收縮。

pH敏感性水凝膠可分為陽離子水凝膠和陰離子水凝膠。陽離子材料的膨脹和收縮行為依賴于水凝膠內陽離子側基的解離。當周圍的 pH 值低于水凝膠的酸解離常數(shù) (pKa) 時，水凝膠鏈上的氨基/亞胺基團被質子化，使內在中和的水凝膠帶正電，從而導致膨脹。隨著帶電離子的遷移，產生離子濃度梯度，由于滲透壓的差異導致水凝膠膨脹。關于陰離子水凝膠，例如羧甲基殼聚糖，由于酸性基團（例如羧基）的電離，它在較高的 pH 值 (> pKa) 下顯示出膨脹行為。由水凝膠網絡內的電離負電荷基團引起的類似排斥導致最終膨脹。相反，當 pH 值反向變化時，pH 敏感材料的收縮行為會以相反的方式發(fā)生。

溶脹：

當放入熱力學相容的溶劑中時，溶脹是水凝膠的基本行為。在開始與水分子接觸時，這些分子與水凝膠鏈相互作用并滲透到網絡中。因此，未溶劑化的玻璃相通過移動屏障從堅固的水凝膠區(qū)域分離。這種處于橡膠相的水凝膠網絡將膨脹并允許更多的水分子填充水凝膠網絡。這種機制已經很好地建立起來，并且已經開發(fā)出一種新方法來實時可視化水凝膠膨脹過程中的動態(tài)變形�；�于共價連接到凝膠網絡的籠狀光活化熒光團，監(jiān)測水凝膠在受限幾何形狀中的膨脹。借助這項技術，可以得出結論，這種膨脹過程是一個連續(xù)的運動，直到到達邊界。當來自水凝膠網絡的滲透壓和彈力在凝膠的一定體積下達到平衡時，水凝膠網絡的拉伸停止，并保持該狀態(tài)。

氣體發(fā)泡：

傳統(tǒng)的氣體發(fā)泡技術通過與含氣體或生成溶液混合來生成多孔水凝膠結構。隨著氣體占據聚合物的空間，聚合物的整個體積膨脹。聚合物內的氣體發(fā)泡過程分為三個步驟：氣體/聚合物溶液的配制、氣孔的成核和氣泡的體積膨脹。該技術的關鍵發(fā)展是氣體/聚合物溶液的配制，這受聚合物基質內氣體分布的控制。然而，氣體擴散過程通常很慢，通常需要多個循環(huán)才能達到理想的分布。因此，各種技術都集中在提高擴散速率上，例如提高氣體壓力或提高溶液溫度。

其他機制：

納米顆粒由于其生物相容性、靶向特性和加載效率而長期用作藥物遞送載體。對于配位聚合物和多孔配位網絡，納米粒子在調節(jié)網絡結構方面也起著至關重要的作用。另一個令人興奮的策略是使用可變形納米粒子來增強膨脹后的水凝膠機械性能。水凝膠溶脹后，封裝的分子從脂質體中釋放出來，隨后在原始水凝膠網絡之間誘導二次水凝膠網絡的形成。因此，與標準溶脹水凝膠相比，這種剛性雙交聯(lián)網絡能夠增強機械性能。為此，納米粒子的存在通過在水凝膠網絡內產生或去除空間而在形成膨脹或收縮行為方面發(fā)揮著重要作用。

交聯(lián)比變化是設計可收縮和可膨脹（生物）材料的另一種有用方法。在水凝膠的光交聯(lián)過程中，由于光密度分布不均勻，通常會發(fā)現(xiàn)不均勻交聯(lián)的網絡。不均勻的溶脹導致網絡中不同的膨脹率，而不均勻的去溶劑化導致不同的收縮程度。交聯(lián)密度的空間分布可以通過管理光聚合過程中的光模式來調節(jié)。基于這一事實，研究表明，由于單個水凝膠片內不同程度的光交聯(lián)，3D 水凝膠薄膜在收縮或膨脹時可以將 3D 水凝膠薄膜轉化為復雜的 3D 結構。

可收縮材料的應用

再生醫(yī)學與疾病建模

最近，作者團隊報道了一種新方法[1]，稱為通過對生物打印結構進行后處理來縮小生物打印。陰離子水凝膠甲基丙烯酸化透明質酸 (HAMA) 被選為 3D 生物打印的生物墨水，然后通過殼聚糖的陽離子溶液進行后中和。與原始水凝膠相比，這種方法使水凝膠的高度和直徑縮小了約 61%，最終體積縮小了 21%。另外，還研究了嵌入 HAMA 水凝膠中的熔融靜電紡絲印刷聚己內酯 (PCL) 網狀微通道結構。在相同的收縮條件下，制造的微通道從 39 μm 收縮到 10 μm，接近單毛細管尺寸。

總體而言，對不同生物打印收縮方法的幾項概念驗證研究得出的結論是，這種獨特的收縮生物打印策略具有潛在的廣泛適用性和細胞友好性，并且可以顯著提高打印精度。

體外診斷

最近，Khine 及其同事報告了一種通過將形狀記憶聚烯烴薄膜與薄金屬片集成在一起的收縮誘導電極[2]。熱收縮后，薄電極的體積縮小了 95% 以上，更重要的是，它提供了更高的分辨率和更好的導電性。值得一提的是，這些成果優(yōu)于光刻法本身或其他采用形狀記憶材料的方法。

在另一項研究中，Yang和同事開發(fā)了光子晶體 (PC) 結構[4]，通過 3D 打印方法，利用光學干涉效應反射顏色。波長與晶格間距是函數(shù)關系，因此，當矩陣響應外部輸入而擴展或收縮時，顏色會發(fā)生變化。他們通過控制加熱時間來精確控制反射顏色。他們的研究結果表明，收縮后晶格常數(shù)小至 280 nm，可與蝴蝶尺度中最精細的周期性相媲美，并且比機器規(guī)格小兩倍。這種通過收縮著色的方法可以作為在微觀尺度上在所有維度方向上打印任意顏色和結構時克服分辨率限制的替代方法。隨著技術的進一步進步，在微觀尺度上更具吸引力的比色結構將為與其他設備的集成提供一個強大的平臺。

納米技術在藥物和基因傳遞、生物成像和醫(yī)療植入等方面的應用已得到研究。例如， 及其同事發(fā)明了一種 3D 納米制造策略，稱為ImpFab，通過該策略實現(xiàn)了納米級的 3D 結構。他們選擇聚丙烯酸酯/PAAm 作為支架材料，可以通過酸或二價陽離子誘導的收縮將其減小到納米級尺寸。由于熒光素光漂白產生的自由基反應，活化的熒光素分子與水凝膠內的活性丙烯酸酯基團交聯(lián)。在 ImpFab 中，攜帶 DNA、蛋白質、小分子或納米顆粒的熒光分子通過雙光子光刻沉積到水凝膠基質中。收縮和脫水后，獲得功能性 3D 納米結構，在線性維度上顯示十倍的收縮。值得注意的是，多種材料能夠獨立地沉積在單個構造中。

Tibbits 最初在 2014 年將 4D 打印的定義定義為“3D 打印 + 時間”，在過去幾年中，該定義已經演變?yōu)楫?D結構受到水、熱、光或 pH 值等刺激時， 3D 打印結構的形狀、屬性和功能會隨著時間改變。智能材料是4D打印的基本要素，可分為形狀記憶材料、自感知材料、自適應材料、自修復材料和決策材料等多種類別。另一方面，3D 打印允許以適當?shù)膸缀涡螤顦嫿ň哂卸喾N刺激響應材料的目標對象，從而產生 4D 變化所需的變形行為。4D 打印中的變形行為可以通過折疊、彎曲、扭曲、表面卷曲、收縮或收縮從 1D 到 1D/2D/3D、2D 到 2D/3D 、3D 到 3D 生成和/或擴展過程。

形成復雜的雙曲面形狀受到單一材料收縮和簡單圖案化的挑戰(zhàn)，因為它需要面內水平和厚度方向的生長梯度�？紤]到這一點，Lewis 和同事開發(fā)了一個多材料 4D 打印平臺，用于創(chuàng)建彎曲的幾何形狀。[ 10 ]

可膨脹材料的應用

組織再生通常需要替代支架來替換缺損組織并重塑缺損和周圍組織。關于重塑天然組織結構的一個重點是它們通常固有的異質性和通常復雜的生理結構。例如，許多組織是高度多孔的，具有相互連接的孔隙網絡，有助于促進：細胞生長、氧氣和營養(yǎng)交換以及廢物消除。因此，替代物應該在結構上相似，但在功能上與待替代的天然組織相同。鑒于功能模擬和細胞友好性要求，多孔結構通常是設計替代支架的基本策略。其中，靜電紡絲技術為制造具有互連網絡的高度多孔支架提供了顯著優(yōu)勢。此外，還對該技術進行了進一步修改，例如同軸靜電紡絲，以提高支架的孔隙率。然而到目前為止，大多數(shù)由靜電紡絲技術制造的結構都具有緊密堆積的納米纖維膜，孔徑極小。最近，已經報道了一些例子，可以通過簡單而有效的修改來改善這些膜內的細胞浸潤和組織重塑。

作者團隊進行的另一個激動人心的應用，展示了一種具有擴展方法的微通道嵌入紙裝置[12]。我們首先使用基質輔助 3D 打印制造了一個可灌注的微通道結構，周圍環(huán)繞著壓實的細菌纖維素納米纖維。然后，精確控制不同濃度和浸泡時間的 NaBH4 的氣體發(fā)泡策略成功地保持了微通道的完整性，周圍有更多的多孔結構，從而導致更好的空間細胞浸潤和相互作用。這項研究提供了一種互補的策略，可以建立一個有效的血管化組織模型，并在床旁護理臨床前藥物篩選中展現(xiàn)出巨大的應用潛力。

給藥系統(tǒng)

一般水凝膠的溶脹性質具有從水凝膠網絡中釋放負載試劑的能力。例如，Magdassi 及其同事報道了用于藥物輸送的水凝膠的溶脹特性[13]，他們利用基于數(shù)字光處理的 3D 打印方法制造了裝載有硫羅丹明 B 的不同結構。將它們浸入磷酸鹽緩沖液中 24 小時后，不同形狀的構建體表現(xiàn)出超過其原始尺寸 3-15 倍的膨脹，并將所有負載的染料分子釋放到周圍的溶液中。他們還觀察到，膨脹尺寸的變化對于表面積與體積的比率是必不可少的，這與打印的 3D 立方體、圓柱體、墊子、球體或金字塔結構不同。因此，這些發(fā)現(xiàn)使他們得出結論，具有復雜幾何形狀的構造的形態(tài)在溶脹和藥物釋放行為中起著至關重要的作用。

溫度響應水凝膠作為另一種刺激響應藥物遞送平臺，在可控藥物遞送方面發(fā)揮著關鍵作用。例如，具有尺寸/形狀可收縮和可膨脹特性的基于 PNIPAAm 的材料會導致藥物釋放。Xia 及其同事提出了在加熱下從基于 PNIPAAm 的共聚物涂覆的金納米籠中有效釋放阿霉素的方法。[15]當溫度在激光照射下升高時，由于水凝膠網絡的坍塌和金納米籠上的孔的暴露，聚合物涂層收縮導致藥物釋放。這個釋放過程非常快，加熱后 1 分鐘內顯示出突釋曲線，釋放所有負載藥物僅需要 10 分鐘。

成像工具

隨著ExM策略的出現(xiàn)，其他相關的擴展方法也被提出。迭代擴展顯微鏡 (iExM) 可以進一步擴展前 ExM 樣本。第一個可溶脹聚電解質凝膠網絡是基于原始 ExM 協(xié)議使用化學可裂解交聯(lián)劑生成的，這使得第一個凝膠可以溶解并為第二輪可溶脹聚合物嵌入和膨脹打開空間。iExM 實現(xiàn)了 ≈4.5 × 4.5 或 ≈20 倍的最終擴增，并使用傳統(tǒng)顯微鏡實現(xiàn)了 25 nm 的細胞和組織成像分辨率。

4D打印

基于水凝膠膨脹的特性并受植物系統(tǒng)的啟發(fā)，Lewis 及其同事探索了打印含有纖維素原纖維的水凝膠墨水的能力，這些墨水用于模擬植物細胞壁[17]。使用雙層結構系統(tǒng)，通過在頂層和底層沉積具有不同溶脹特性的墨水來實現(xiàn)曲率。他們通過圓形和正交雙層晶格的組合成功地創(chuàng)建了高斯曲率和功能性折疊花形狀。

文章總結

總體而言，可收縮和可膨脹（生物）材料已被用作（生物）制造平臺，通過不同機制測量，實現(xiàn)更可控和更精確的變形方法。憑借這些特性，已經在組織再生、疾病建模、診斷、4D（生物）打印和藥物輸送領域進行了大量生物醫(yī)學應用。這份進展報告總結了具有代表性的尺寸/形狀變化機制，例如基于 pH、溫度、溶脹、靜電相互作用、納米技術和交聯(lián)率的機制，以及不同領域的相關生物醫(yī)學應用。在未來，使用不同（生物）制造技術加工的可收縮和可膨脹（生物）材料可能會為開發(fā)用于先進細胞或藥物輸送的原位組織植入物和便攜式超靈敏診斷設備開辟新的可能性。將進一步推動更具啟發(fā)性的策略，在這些令人興奮的領域提供新的途徑，以增強這種獨特類型的（生物）制造場景。

參考文獻

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