上海交大周廣東團(tuán)隊(duì)：骨再生單元復(fù)合脫鈣骨框架材料修復(fù)大體積骨缺損

臨床上，對(duì)于外傷性、退行性疾病或腫瘤切除后導(dǎo)致的大體積骨缺損的生理性修復(fù)一直是重大的挑戰(zhàn)，這不僅要求植入材料能夠充分填充大體積骨缺損區(qū)域，而且更重要的是需要恢復(fù)受損部位正常的生理功能。最新研究成果表明，基于組織工程原理構(gòu)建的、具有生物活性的組織工程骨對(duì)于骨缺損的生理功能重建具備獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，臨床治療效果甚至優(yōu)于自體骨組織。雖然，脫鈣骨基質(zhì)（DBM）因其固有的骨仿生結(jié)構(gòu)、礦化成分、生物相容性和成骨活性，被認(rèn)為是臨床上理想的骨再生材料，但是仍然面臨細(xì)胞負(fù)載率低和成骨誘導(dǎo)活性成分損失等問題，嚴(yán)重制約了組織工程骨的臨床轉(zhuǎn)化。

近期，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院、上海市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、組織工程國家工程研究中心周廣東團(tuán)隊(duì)，提出了一種骨再生單元復(fù)合脫鈣骨框架材料構(gòu)建組織工程骨及大體積骨缺損修復(fù)的新策略。研究者首先通過微流控技術(shù)制備具有成骨微環(huán)境仿生的光交聯(lián)甲基丙烯酸酯明膠/透明質(zhì)酸（GelMA/HAMA）微凝膠（如圖1），然后接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）并進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)構(gòu)建骨再生單元（BRUs）：1）BRUs可以直接注射至裸鼠皮下實(shí)現(xiàn)異位成骨（即“可注射骨”）；2）BRUs也可以復(fù)合DBM框架材料構(gòu)建具有三維形態(tài)的組織工程骨，并成功修復(fù)了兔子脛骨缺損。相關(guān)研究論文：“Large-sized bone defect repair by combining a decalcified bone matrix framework and bone regeneration units based on photo-crosslinkable osteogenic microgels”發(fā)表于雜志Bioactive Materials（IF=14.593）上。

圖1 骨再生單元復(fù)合脫鈣骨框架材料修復(fù)脛骨缺損策略的示意圖

1. 成骨微環(huán)境仿生光交聯(lián)微凝膠的理化性能表征
研究者利用微流控技術(shù)對(duì)負(fù)載成骨活性成分DBM微粒和血管化生長因子VEGF的凝膠液體進(jìn)行光聚合制備GelMA/HAMA水凝膠微球（VDGH），成功構(gòu)建了具有成骨微環(huán)境仿生功能的微凝膠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VDGH微凝膠的理化性質(zhì)能夠通過微流控和光交聯(lián)技術(shù)的結(jié)合可控調(diào)節(jié)，例如微球尺寸、均一度、力學(xué)強(qiáng)度、活性因子釋放和生物降解性等（如圖2）。

圖2 成骨微環(huán)境仿生光交聯(lián)微凝膠的理化性能表征

2. 骨再生單元構(gòu)建及生物學(xué)評(píng)價(jià)
研究者首先優(yōu)化了骨再生單元構(gòu)建的接種條件，并確認(rèn)了60 mil/mL的 BMSCs接種于300 μm微凝膠能夠獲得最佳的細(xì)胞接種效率和增殖效果。然后，實(shí)驗(yàn)通過活/死細(xì)胞染色和鬼筆環(huán)肽染色表征了BMSCs接種于VDGH微凝膠培養(yǎng)1，4，7和14天后的細(xì)胞鋪展、增殖、和細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況（如圖3）。接著，經(jīng)過成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后，接種干細(xì)胞的VDGH微凝膠逐漸形成了成骨基因和蛋白表達(dá)相對(duì)成熟的骨再生單元（如圖4）。

圖3 骨再生單元的生物學(xué)評(píng)價(jià)

圖4 體外成骨誘導(dǎo)分化評(píng)價(jià)

3. 可注射骨構(gòu)建及生物學(xué)評(píng)價(jià)
研究者將上述方式構(gòu)建的BRUs注射至裸鼠皮下，并系統(tǒng)地進(jìn)行了DNA含量、力學(xué)性能、濕重、體積、Micro-CT和組織學(xué)評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，體內(nèi)植入8周后BRUs能夠再生成熟的骨組織，包括大量的骨特異性ECM沉積、清晰的骨小梁結(jié)構(gòu)和豐富的血管長入（如圖5）。BRUs穩(wěn)定的骨再生潛力可能歸因于以下優(yōu)勢(shì)：1）微凝膠表面粘附的BMSCs具有足夠的機(jī)會(huì)接觸成骨誘導(dǎo)信號(hào)，以便于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-ECM的相互作用，大大加快了BMSCs的成骨誘導(dǎo)分化；2）相比于整塊水凝膠而言，微凝膠之間的大孔結(jié)構(gòu)保證了營養(yǎng)物質(zhì)的充分滲透和運(yùn)輸；3）微凝膠的間隙以及促血管生成的仿生微環(huán)境（VEGF緩釋）有利于血管長入，從而促進(jìn)再生骨組織的血管化。因此，具有良好可注射性和骨再生潛力的BRUs，將為骨缺損的微創(chuàng)治療提供潛在的應(yīng)用前景。

圖5 體內(nèi)可注射骨構(gòu)建及生物學(xué)評(píng)價(jià)

4. 三維形態(tài)的組織工程骨構(gòu)建及脛骨缺損修復(fù)評(píng)價(jià)
研究者將BRUs復(fù)合DBM框架材料植入裸鼠皮下，并成功再生了具有三維形態(tài)的組織工程骨（如圖6）。這一策略不僅克服了可注射BRUs在三維形態(tài)控制和力學(xué)維持上的缺陷，也有效解決了DBM支架材料在細(xì)胞接種率低和成骨仿生微環(huán)境缺失等方面的問題。最后，具有三維形態(tài)的組織工程骨成功修復(fù)了兔子15 mm長的脛骨缺損（如圖7）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，理想的骨修復(fù)效果歸功于充足的細(xì)胞接種量，BRUs提供的成骨和血管化仿生微環(huán)境，以及激活內(nèi)源性BMSC歸巢?？傊?dāng)前的研究創(chuàng)新性地開發(fā)了一種理想的骨仿生微載體，這將為骨再生和大體積骨缺損修復(fù)提供一種嶄新的策略。

圖6 三維形態(tài)的組織工程骨構(gòu)建及生物學(xué)評(píng)價(jià)

圖7 三維形態(tài)的組織工程骨應(yīng)用于兔子脛骨缺損修復(fù)

本論文第一作者：郝俊祥、白寶帥、慈政；通訊作者：任文杰、華宇杰、周廣東。該工作得到了新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院任文杰教授團(tuán)隊(duì)的共同合作完成，材料學(xué)表征得到了上海交大朱麟勇教授團(tuán)隊(duì)的大力支持。此外，該工作還得到了國家重大研發(fā)計(jì)劃（2017YFC1103900）、國家自然科學(xué)基金（81871502，81701843和81671837）等項(xiàng)目支持。

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.12.013