生物3D打印人類皮膚，同時打印6種細胞極為罕見，“數(shù)量”也是一種創(chuàng)新

來源：先進材料

生物打印是一種有前途的替代方法來生產(chǎn)皮膚替代品，因為它可以復制皮膚的結(jié)構(gòu)組織進入仿生層體外。在這項研究中，六種原代人類皮膚細胞類型被用來生物打印一個由表皮、真皮和皮下組成的三層皮膚構(gòu)建體。將生物打印的皮膚與人類細胞移植到 nu/nu 小鼠的全厚傷口上促進了類似于天然人類表皮的表皮網(wǎng)狀脊的快速血管化和形成，具有正常外觀的細胞外基質(zhì)。細胞特異性染色證實了植入的細胞與再生皮膚的整合。

使用類似的方法，在豬切除傷口模型中，將5厘米乘5厘米生物打印的自體豬皮移植物移植到全層傷口上。生物打印皮膚移植改善皮膚脫皮，減少皮膚收縮，支持正常的膠原組織，減少纖維化。生物印跡自體皮片移植創(chuàng)面的差異基因表達顯示了促重塑蛋白酶活性。這些結(jié)果表明，生物打印皮膚可以支持皮膚再生，以允許非纖維化傷口愈合，并表明皮膚生物打印技術(shù)可能適用于人類臨床應(yīng)用。

擠壓生物打印用于用人類細胞[表皮角質(zhì)形成細胞，黑素細胞，真皮成纖維細胞，F(xiàn)DPCs，真皮微血管 EC (DMECs)和脂肪細胞]制備多層仿生皮膚結(jié)構(gòu)(圖1A)。將細胞懸浮于三種基于纖維蛋白原的水凝膠生物墨水中(圖1B) ，并連續(xù)用層層生物墨水沉積印刷，以形成由人類皮膚，真皮和皮下組成的3cm × 3cm 三層仿生皮膚構(gòu)建體(圖1C)。細胞表現(xiàn)出正常的表型，經(jīng)細胞特異性標記證實(圖 S1)。在體外第7天(活細胞的77.7% ± 10.9) ，細胞活力在第13天和第21天維持在生物打印的皮膚中，細胞活力降低(分別為活細胞的58.2% ± 17.6和62.0% ± 36.9)(圖1，D 和 E)

生物打印和培養(yǎng)4天后，將生物打印的皮膚移植到小鼠的2.5 cm × 2.5 cm 全厚度傷口中，然后進行90天(圖2A)。對照組包括僅使用水凝膠的生物打印對照組和未經(jīng)處理的傷口。數(shù)字圖像和平面測量用于監(jiān)測全傷口閉合，收縮和上皮化(圖1)。S2) ，有證據(jù)表明在前面描述的早期時間點上皮化改善(20)。到第14天，所有生物打印的皮膚處理的傷口完全閉合(分別為100.0.0% 和64.1 ± 5.0% ，64.8 ± 13.9% ; P < 0.0001)(圖2B)。所有三組均表現(xiàn)出收縮，在整個愈合過程中組間無顯著差異(分別為49.6 ± 20.3% ，53.8 ± 9.7% 和54.5 ± 12.4% ; P > 0.05) ，傷口閉合時間的差異是由于生物印刷皮膚處理的傷口早期上皮化(圖2C 和圖2)。中二)

早期新血管生成對愈合真皮的發(fā)育至關(guān)重要，并為長期傷口愈合提供必要的營養(yǎng)。人類皮膚(圖3A)和生物打印皮膚(圖3B)免疫熒光染色顯示具有人 CD31陽性 EC 的內(nèi)層(綠色)和 CD146陽性周細胞的外層(紅色)的血管腔，表明植入的人 EC 參與形成新生血管冠狀動脈在再生皮膚和成熟通過招募宿主小鼠周細胞�；蛘�，天然小鼠皮膚，水凝膠和僅傷口對照每個顯示只有少數(shù) CD146陽性周細胞和沒有人類 CD31陽性細胞(圖3C)。用 CD146(圖3D)和 H & E 染色(圖3E)對毛細血管進行免疫檢測，以定量90天內(nèi)愈合傷口的血管狀況。與對照水凝膠和未處理的傷口相比，生物打印的皮膚處理的傷口顯示出顯著更大的血管密度(24.7 ± 3.8,17.8 ± 3.0,13.7 ± 3.4; P < 0.0001; 圖3F 和圖。S4) ，并且由比水凝膠和未處理的對照更小(< 500μm)和中等大小(500至1000μm)的毛細血管組成(圖3G)。在第42天也出現(xiàn)了類似的趨勢，到第90天，所有組的血管大小分布和密度都正�；�了(圖1)。

臨床翻譯的下一步是將該技術(shù)推廣到一個明確的臨床前豬創(chuàng)傷模型(圖5A)。從皮膚和頸動脈活組織檢查(圖5，B 和 C)分離自體球菌素角質(zhì)形成細胞，成纖維細胞，EC 和前脂肪細胞，并在體外擴增28天。同種異體皮膚細胞平行培養(yǎng)。雖然成功地從活檢組織中獲得細胞并擴增，但所有細胞類型的成功分離和培養(yǎng)在跨治療組和動物中并不一致(表 S2)。

H & E (圖6A)和 Masson 三色(圖6B)染色顯示，與生物打印的移植物和僅水凝膠對照相比，生物打印的自體移植物中表皮厚度和原始脊的存在增加。Picrosirius 紅色染色顯示，生物打印的自體移植物具有與未受損豬皮相似的紅/黃/綠纖維染色比率，并且具有相似的籃狀編織細胞外間質(zhì)(ECM)組織，與生物打印的同種異體移植物和僅水凝膠處理的傷口中的平行的纖維化組織相比，強烈的紅/黃染色的 ECM (圖6C)(13)。免疫熒光染色顯示在生物打印的自體移植物中表皮成熟改善，具有幾個強大的 KRT14 + 基底角質(zhì)形成細胞和愈傷組織蛋白(IVL) + 淺表角質(zhì)形成細胞層(圖6D，頂行)。IVL 和波形蛋白染色的進一步研究顯示，與生物打印的自體移植相比，對照組的纖維母細胞性增加(圖6D，底部行)。

這項研究的發(fā)現(xiàn)受到使用小型和大型動物模型的限制，這些動物模型可能不能完全概括人類傷口愈合。對于松弛的皮膚 nu/numouse 模型尤其如此，在這種模型中，傷口更有可能通過收縮而不是上皮化來關(guān)閉。這項工作也是有限的技術(shù)轉(zhuǎn)化為人類使用。阻礙翻譯的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)是細胞分離和擴增的挑戰(zhàn)。本研究中自體豬生物打印皮膚的生產(chǎn)允許創(chuàng)建自體纖維化和擴張的標準操作程序，生成生理細胞密度(大于10 × 106個細胞/ml 生物墨水)的打印皮膚所需的數(shù)百萬個細胞。通過產(chǎn)生大約5 × 106個細胞/平方厘米的皮膚活檢，我們能夠在28天內(nèi)產(chǎn)生全厚皮膚從9到25平方厘米增加的表面積，沒有嚙合。

在臨床上，這一步驟可以通過在病人初次出現(xiàn)時進行小型穿刺活組織檢查來完成，以便有足夠的時間進行細胞擴增。細胞分離和擴增的過程將需要用自動化組織過程進行優(yōu)化，以充分實現(xiàn)這種技術(shù)的潛力，包括增加細胞產(chǎn)量，自動化細胞培養(yǎng)減少污染，以及評估移植和傷口再生功效的最低必要細胞。

總之，具有多種細胞類型的生物打印人皮膚構(gòu)建體能夠促進和加速小鼠全層創(chuàng)面的愈合。生物印跡豬自體移植物通過再上皮化和減少收縮改善了豬全層傷口的愈合。這種愈合過程導致了非纖維化膠原重塑。這些發(fā)現(xiàn)表明，細胞增殖的移植物支持傷口愈合，自體細胞進一步支持非纖維化表皮和真皮再生。總之，我們的研究結(jié)果表明，生物打印自體皮膚迅速整合到傷口中，以支持皮膚再生，并提出了皮膚生物打印技術(shù)治療全厚度傷口的可能性。

原文：https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.adf7547