三維體外血腦屏障模型研究屏障損傷

供稿人：王森、王玲
供稿單位：西安交通大學(xué)機(jī)械制造系統(tǒng)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
來(lái)源：中國(guó)機(jī)械工程學(xué)會(huì)增材制造技術(shù)（3D打印）分會(huì)

血腦屏障(BBB)的破壞與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)。體外血腦屏障模型能夠研究屏障對(duì)外部損傷的反應(yīng)。近期，蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的Modena和Wei Wei等人提出了一種基于人源細(xì)胞的新型三維BBB平臺(tái)，包含人腦內(nèi)皮細(xì)胞、原代周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，平臺(tái)集成了透明電極，可用于高分辨率實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)屏障緊密性。利用該平臺(tái)證明了氧-葡萄糖剝奪(OGD)條件下可重現(xiàn)缺血損傷的特征：內(nèi)皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的快速重塑和隨后的形態(tài)學(xué)改變。高分辨率實(shí)時(shí)成像顯示，在OGD應(yīng)用過(guò)程中，內(nèi)皮層形成了大的肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維束，最終導(dǎo)致細(xì)胞收縮和屏障破裂。同時(shí)電測(cè)量表明，在應(yīng)力纖維出現(xiàn)之前，屏障電阻迅速下降，這表明在劇烈的形態(tài)變化出現(xiàn)之前，屏障功能已經(jīng)受到損害。通過(guò)多種缺血相關(guān)評(píng)價(jià)結(jié)果的綜合對(duì)比證實(shí)了該體外血腦屏障平臺(tái)可概括主要的屏障功能，并可用于研究外部刺激下血腦屏障的快速重構(gòu)過(guò)程。相關(guān)論文發(fā)表在Advanced Science雜志上。

如圖1所示，本研究所開(kāi)發(fā)的三維血腦屏障平臺(tái)具有以下優(yōu)勢(shì)：（1）具備仿生的三維多細(xì)胞BBB結(jié)構(gòu)，包括由貼壁的內(nèi)皮細(xì)胞組成血管流體通道，內(nèi)皮細(xì)胞外側(cè)的包含星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞的3D水凝膠，以模擬腦細(xì)胞外基質(zhì)；（2）通過(guò)對(duì)血腦屏障平臺(tái)施加不對(duì)稱周期性傾斜作用來(lái)對(duì)血管通道施加準(zhǔn)單向流動(dòng)，以模擬內(nèi)皮細(xì)胞所受的剪切應(yīng)力，該方法避免了復(fù)雜的外接泵管系統(tǒng)，可同時(shí)對(duì)八個(gè)樣品同時(shí)操作；（3）通過(guò)集成透明的氧化銦錫（ITO）電極和鉑電極構(gòu)成四電極跨內(nèi)皮電阻（TEER）傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)血腦屏障的實(shí)時(shí)TEER和光學(xué)監(jiān)測(cè)。

圖1 a）體內(nèi)血腦屏障示意圖；b）血腦屏障芯片示意圖；c）血腦屏障芯片平臺(tái)組成及操作說(shuō)明

通過(guò)將BBB模型暴露于氧糖剝奪（OGD）條件下以模擬缺血性損傷，如圖2（a）所示。通過(guò)連續(xù)記錄TEER值并使用活體熒光標(biāo)記肌動(dòng)蛋白（SiR-actin）、細(xì)胞核（Hoechst）和細(xì)胞缺氧指示劑（Image-iT）和高分辨率顯微鏡來(lái)監(jiān)測(cè)屏障變化行為。結(jié)果顯示在OGD條件下暴露30分鐘內(nèi)出現(xiàn)了強(qiáng)烈的SiR-actin信號(hào)所反映的肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維，60分鐘后肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維開(kāi)始聚集，導(dǎo)致ECs收縮，從而導(dǎo)致EC之間連接的損傷和屏障的滲透性的提高。在不同時(shí)間點(diǎn)固定細(xì)胞并通過(guò)免疫熒光監(jiān)測(cè)屏障重構(gòu)情況，結(jié)果表明OGD條件下緊密連接蛋白在細(xì)胞連接處的減少，180分鐘后屏障完全受損，細(xì)胞之間出現(xiàn)孔洞和空隙。持續(xù)的TEER監(jiān)測(cè)表明在觀察到肌動(dòng)蛋白聚合前屏障就存在破壞，TEER值在3h內(nèi)持續(xù)下降至最初的88.4%，通透性顯著增加了約20倍。

圖2 a) 芯片上再現(xiàn)缺血性損傷的實(shí)驗(yàn)流程示意圖; b) OGD暴露后不同時(shí)間點(diǎn)的芯片上細(xì)胞屏障成像；（c）OGD暴露后芯片TEER值；(d) OGD暴露3h后4kDa FITC-Dextran滲透性；(e) 正常和OGD條件下內(nèi)皮細(xì)胞基于表達(dá)差異

綜上所述，該研究建立了一個(gè)高度集成、方便操作的BBB模型平臺(tái)，可以用來(lái)重現(xiàn)屏障功能，并研究?jī)?nèi)皮層在外部損傷后的快速變化。利用BBB平臺(tái)模擬腦缺血，該模型有助于闡明屏障破壞的機(jī)制，為開(kāi)發(fā)腦和BBB相關(guān)疾病的治療藥物提供了工具。

參考文獻(xiàn)：
Wei W, Cardes F, Hierlemann A, Modena M. 3D In Vitro Blood‐Brain‐Barrier Model for Investigating Barrier Insults[J]. Advanced Science, 2023, 10.