哈佛大學| 明膠纖維引導3D打印心室中的心肌細胞排列

來源： GK綠鑰生物科技

美國哈佛大學Kevin Kit Parker教授團隊在《Nature Materials》期刊發(fā)表論文“Fibre-infused gel scaffolds guide cardiomyocyte alignment in 3D-printed ventricles”，開發(fā)了一種含有預制明膠纖維的水凝膠墨水，用于打印3D器官級支架，再現(xiàn)心臟的細胞內(nèi)和細胞間組織。作者通過將預制明膠纖維添加到水凝膠中可以控制墨水流變性，實現(xiàn)受控的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，以實現(xiàn)獨立3D結(jié)構(gòu)的精確打印，而無需額外的支撐材料。在墨水擠壓過程中，剪切誘導的纖維排列提供了微尺度的幾何線索，促進了體外培養(yǎng)的人類心肌細胞向各向異性肌肉組織的自組織，3D打印心室體外模型具有仿生各向異性電生理和收縮特性。

WHAT——什么是明膠纖維？

明膠纖維是一種合成纖維，通常由明膠為原料制成，可以與天然的膠原纖維相媲美，其尺寸通常在1.3 μm到8.7 μm之間，這種纖維具有較好的力學性能，并且與某些細胞具有良好的相容性。明膠纖維與纖維表面的相互作用原理包括物理和化學相互作用，能增加纖維之間的接觸面積，提高結(jié)合的強度。
WHY——為什么要用生物3D打印的方法來制造心臟組織？

目前研究人員更多是通過微接觸印刷、光刻、定向冷凍干燥、纖維紡絲和微生理芯片制造來設計心臟組織，但這些方法在制造完全復制心臟功能的復雜幾何組織的能力方面受到限制。而生物3D打印的優(yōu)勢就在于能夠制造復雜、生物相容性更強的結(jié)構(gòu)，可以精確地復制細胞和組織的原始結(jié)構(gòu)。
HOW——作者通過將明膠纖維注入明膠和海藻酸鹽(Gel-Alg)水凝膠基質(zhì)來設計墨水。

圖1 開發(fā)打印具有細胞對齊線索的獨立式3D打印組織支架的明膠墨水

將纖維融入水凝膠中可以改變墨水的流變性，從而無需任何支撐結(jié)構(gòu)或材料即可創(chuàng)建精確且復雜的3D支架。通過排列明膠微纖維的形式，結(jié)合拓撲和化學線索來打印的3D心室支架能促進心肌細胞自組織成各向異性肌肉組織。在制造纖維注入凝膠(FIG)墨水后，作者打印了由明膠纖維和Gel-Alg水凝膠組成的3D支架。在打印過程中，噴嘴內(nèi)的剪切應力足以使具有彈性的FIG墨水變成液體，擠壓后恢復其彈性穩(wěn)定性。這些非線性流變特性允許FIG墨水連續(xù)擠壓，還能夠打印復雜的幾何形狀的分層結(jié)構(gòu)，且無需犧牲層或犧牲浴作為支撐結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)自我支撐的空心3D結(jié)構(gòu)�？傊�，凝膠狀FIG墨水的高彈性模量提供了足夠的凝膠穩(wěn)定性，可以打印厚度在200 μm到350 μm之間的自支撐壁，而不需要支架或犧牲浴。

圖2 在明膠纖維灌注凝膠的打印支架上，培養(yǎng)心臟組織的各向異性細胞內(nèi)和細胞間組織

為了評估FIG墨水打印支架在增強心肌細胞的細胞內(nèi)和細胞間組織、肌原纖維組織和排列的能力，作者將新生大鼠心室心肌細胞（NRVM）接種在打印的二維（2D）FIG支架上。結(jié)果得到高度排列的心臟組織的形成，相對于多形性培養(yǎng)條件保留了相當?shù)募毎�活力。接下來作者通過計算取向順序參數(shù)(OOP)來測量結(jié)構(gòu)組織的各向異性程度，該參數(shù)量化了肌聚體 α-肌動蛋白和細胞骨架肌動蛋白絲(F -肌動蛋白)排列。細胞內(nèi)和細胞間骨架結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的預應力決定了細胞核的伸長和取向，與對照Gel-Alg支架上的細胞核相比，F(xiàn)IG支架上的細胞核被拉長，NRVM的核取向也沿打印方向排列(0°)，而Gel-Alg支架的核取向無特異性取向。

圖3 多向各向異性心臟組織的機電耦合動力學

為了測試FIGs誘導心肌細胞沿纖維結(jié)構(gòu)自組織并形成心臟功能合胞體的能力，作者測量細胞-細胞連接結(jié)構(gòu)的功能后果及其電生理特性。作者使用光學作圖來測量鈣(Ca2+)瞬態(tài)傳播，作為相對于打印方向沿縱向和橫向軸的心臟脈沖傳導的指標。最后結(jié)果表明，F(xiàn)IG支架上的心臟組織在6厘米的蛇形圖案上傳播Ca2+波，顯示出沿打印方向的強大電耦合。利用NRVM和人誘導多能干細胞源性心肌細胞(hiPSC-CMs)在FIG支架上構(gòu)建心臟組織的橫縱傳播速度值分別為1.67±0.085和1.62±0.18。相比之下，沒有纖維的對照支架上的NRVM組織的傳播速度比接近1。心肌細胞沿打印方向的優(yōu)先機電耦合使其在電刺激下產(chǎn)生循環(huán)變形，在一個支架中交替排列方向也表明心肌細胞組織遵循局部纖維方向，導致相應的局部組織收縮模式。

圖4 基于人類干細胞的組織工程，三維心室模型的結(jié)構(gòu)、電生理和收縮特性

作者在3D打印的心室支架上培養(yǎng)NRVM和hiPSC-CMs，纖維呈圓周排列，形成三維心室形狀的層狀各向異性心臟組織。體外心室模型在培養(yǎng)中保持14天，自發(fā)心跳率為每秒~0.71次。這表明該支架在超過80萬次的機械載荷循環(huán)中是耐用的，沒有明顯的退化。作者在對NRVM培養(yǎng)的腦室模型進行點電刺激后，觀察到Ca2+在橫向(打印方向)的瞬時傳播速度比縱向更快。這證實了3D打印腦室支架中的脈沖傳播也沿著組織排列發(fā)生，這是由打印方向決定的。為了評估hiPSC-CM心室模型的收縮性能，作者使用粒子成像測速 (PIV) 測量了基底開口處的流體動力學輸出，粒子流的方向和速度使能夠估計收縮和松弛期間流體運動的質(zhì)量通量。最后計算出hiPSC-CM 培養(yǎng)心室模型的心室容積在峰值收縮和峰值舒張之間的變化為5.94±1.66%，比先前報道的NRVM和hiPSC-CM體外心室模型的數(shù)值(射血分數(shù))分別高出2-5倍和8-20倍。

結(jié)論：作者展示了用基于水凝膠的FIG墨水3D打印組織工程心室模型的能力，該模型同時再現(xiàn)了心臟的微結(jié)構(gòu)ECM結(jié)構(gòu)和宏觀結(jié)構(gòu)器官水平幾何形狀。注入明膠纖維在水凝膠墨水中充當流變改性劑，能夠在不使用犧牲浴的情況下打印復雜的3D物體。這些纖維還提供生化和微觀結(jié)構(gòu)線索，促進細胞粘附和自組織成為功能性合胞體。這項工作表明FIG墨水打印將在促進標準化和可訪問的生物打印過程中發(fā)揮重要作用，以微結(jié)構(gòu)精度再現(xiàn)天然器官幾何形狀。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41563-023-01611-3