3D打印骨修復(fù)研究：分級(jí)組裝支架中實(shí)現(xiàn)羥基磷灰石的可控釋放

來(lái)源：EFL生物3D打印與生物制造

在骨修復(fù)領(lǐng)域，當(dāng)前面臨著重大挑戰(zhàn)。骨具有復(fù)雜的層次結(jié)構(gòu)和多孔網(wǎng)絡(luò)，其再生過(guò)程呈現(xiàn)出時(shí)間和空間的復(fù)雜性，涉及多個(gè)階段及同步的生物過(guò)程。然而，大多數(shù)骨修復(fù)材料僅注重空間結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，忽略了骨發(fā)育過(guò)程中的時(shí)間復(fù)雜性，無(wú)法有效響應(yīng)甚至阻礙骨愈合，導(dǎo)致骨再生質(zhì)量不佳。同時(shí)，羥基磷灰石（HAp）在骨再生中雖至關(guān)重要，但其結(jié)構(gòu)和空間分布的調(diào)控一直是難題，不同結(jié)晶度和形態(tài)的 HAp 對(duì)骨愈合影響各異 。

為解決這些痛點(diǎn)，來(lái)自四川大學(xué)的樊渝江、孫勇教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了相關(guān)研究。他們結(jié)合 3D 打印技術(shù)與超臨界 CO₂ foaming 技術(shù)，通過(guò)有機(jī) - 無(wú)機(jī)整合和表面成核生長(zhǎng)的方式，將結(jié)構(gòu)化的 HAp 集成到分級(jí)組裝支架中。利用可控沉積和分級(jí)組裝技術(shù)，調(diào)控微納結(jié)構(gòu)化 HAp 的空間分布和釋放時(shí)間，使其與骨愈合過(guò)程相匹配。相關(guān)工作以 “Spatially programmed hydroxyapatite in hierarchically assembled scaffold self - adapts osteogenic progression” 為題發(fā)表在《Chemical Engineering Journal》上，為骨修復(fù)材料的設(shè)計(jì)提供了新方向，有望實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的骨再生。

研究?jī)?nèi)容
1. 裝飾有空間編程羥基磷灰石的分級(jí)組裝支架自適應(yīng)成骨進(jìn)程
通過(guò)構(gòu)建分級(jí)組裝支架并調(diào)控其中球形 HAp（sHAp）和納米花狀 HAp（fHAp）空間分布與釋放時(shí)間的研究方法，研究了支架對(duì)免疫微環(huán)境的改善作用、為骨基質(zhì)成熟提供鈣 / 磷來(lái)源的能力以及與整個(gè)骨再生周期的匹配情況。結(jié)果表明，調(diào)控 sHAp/fHAp 的空間分布和釋放時(shí)間，能有效改善免疫微環(huán)境，提供滿(mǎn)足骨基質(zhì)成熟所需的鈣 / 磷，使支架自適應(yīng)骨再生的各個(gè)階段，實(shí)現(xiàn)從促進(jìn)早期免疫調(diào)節(jié)到為骨組織生長(zhǎng)持續(xù)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能，最終達(dá)成與骨再生周期的良好匹配，促進(jìn)高質(zhì)量骨再生。

圖 1. 裝飾有空間編程羥基磷灰石的分級(jí)組裝支架自適應(yīng)成骨進(jìn)程示意圖

2. 納米花狀 fHAp 的制備與表征
通過(guò)在 PLGA 或 HC 薄膜表面利用模擬體液（SBF）溶液進(jìn)行可控沉積的方法制備納米花狀 fHAp，運(yùn)用掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）觀察其微觀形貌，使用 X 射線衍射（XRD）分析相組成和結(jié)晶度，采用接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)定表面親水性，利用 TG/DSC 測(cè)試樣品的相轉(zhuǎn)變溫度和無(wú)機(jī)成分含量，借助 X 射線光電子能譜（XPS）檢測(cè) HC 水凝膠中螯合的鈣離子，用鈣比色測(cè)定試劑盒量化鈣離子釋放。研究了 fHAp 的微觀結(jié)構(gòu)、結(jié)晶度、親水性、鈣離子釋放等特性。結(jié)果表明，fHAp 呈花狀，有 50 - 300nm 的多孔結(jié)構(gòu)，結(jié)晶度為 31.24%（相對(duì)于 sHAp），親水性較好，且能更快釋放鈣離子。

圖 2. 納米花狀 fHAp 的制備與表征。

3.納米花狀 fHAp 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞 M2 極化
將炎癥刺激的巨噬細(xì)胞與負(fù)載 fHAp 和 sHAp 的薄膜共培養(yǎng)，運(yùn)用 SEM 觀察細(xì)胞形態(tài)，通過(guò)細(xì)胞骨架染色輔助分析，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞表型，采用 ELISA 試劑盒測(cè)定炎癥相關(guān)蛋白和因子的表達(dá)。研究 fHAp 對(duì)巨噬細(xì)胞極化行為的影響。結(jié)果顯示，fHAp 組巨噬細(xì)胞呈典型 M2 形態(tài)，M2 巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加，M1 巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，同時(shí)抗炎因子 TGF-β1 和 IL-10 表達(dá)升高，促炎因子 TNF-α 和 IL-1β 表達(dá)降低，證明 fHAp 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向 M2 極化。

圖 3. 納米花狀 fHAp 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞 M2 極化。

4. 納米花狀 fHAp 的生物學(xué)功能
通過(guò)水接觸角測(cè)試、激光共聚焦顯微鏡觀察、Transwell 實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、透射電鏡觀察和免疫熒光染色等方法，研究 fHAp 在蛋白質(zhì)吸附、干細(xì)胞遷移與招募、細(xì)胞增殖與鋪展以及膠原礦化方面的能力。結(jié)果表明，負(fù)載 fHAp 的薄膜接觸角更小，蛋白質(zhì)吸附更均勻且強(qiáng)度更高，能更好地促進(jìn)干細(xì)胞遷移和招募，對(duì)細(xì)胞增殖和鋪展的促進(jìn)作用也更明顯，同時(shí)可有效促進(jìn)膠原纖維礦化，使礦化后的膠原纖維在 TEM 下對(duì)比度更高，免疫熒光染色也證實(shí)了這一點(diǎn)。

圖 4. 納米花狀 fHAp 的生物學(xué)功能。

5. 分級(jí)組裝支架的構(gòu)建及免疫調(diào)節(jié)作用
以 3DP PLGA/sHAp 支架為基礎(chǔ)，負(fù)載纖維凝膠螯合的 sHAp 并在表面整合 fHAp 構(gòu)建分級(jí)組裝支架，運(yùn)用 COMSOL Multiphysics 軟件進(jìn)行離子擴(kuò)散模擬，使用 SEM 和激光共聚焦顯微鏡觀察 HAp 分布，通過(guò)細(xì)胞與支架共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞行為和巨噬細(xì)胞極化情況，采用 ELISA 測(cè)定炎癥因子表達(dá)。研究支架的構(gòu)建、HAp 的空間分布與釋放行為以及免疫調(diào)節(jié)功能。結(jié)果顯示，支架中不同位置的 HAp 擴(kuò)散速率不同，且 MHCP 支架能促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和鋪展，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向 M2 極化，降低促炎因子表達(dá)，增加抗炎因子表達(dá)，具有良好的免疫調(diào)節(jié)能力。

圖 5. 分級(jí)組裝支架的構(gòu)建及免疫調(diào)節(jié)作用。

6.成骨分化和膠原礦化
將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）接種在分級(jí)組裝支架上培養(yǎng)，采用堿性磷酸酶（ALP）和茜素紅（ARS）染色觀察細(xì)胞成骨分化和礦化結(jié)節(jié)形成情況，通過(guò)實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR（qRT-PCR）分析成骨和血管生成相關(guān)基因的表達(dá)，利用 Micro-CT 分析裸鼠皮下異位成骨情況，結(jié)合組織學(xué)染色和免疫組化染色觀察新骨形成和膠原纖維礦化。研究分級(jí)組裝支架對(duì) BMSCs 成骨分化和膠原礦化的影響。結(jié)果表明，MHCP 組的 ALP 和 ARS 染色更明顯，相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，裸鼠皮下新骨形成更多，膠原纖維礦化更顯著，證明該支架能有效促進(jìn)成骨分化和膠原礦化。

圖 6. 成骨分化和膠原礦化。

7.分級(jí)組裝支架修復(fù)臨界尺寸顱骨缺損
構(gòu)建兔顱骨缺損模型并植入不同支架，通過(guò)推出試驗(yàn)評(píng)估支架與周?chē)�骨組織的整合能力，利用 Micro-CT 和 X 射線成像系統(tǒng)分析新骨形成情況，采用 RNA 測(cè)序研究分子機(jī)制，結(jié)合免疫熒光染色觀察相關(guān)蛋白表達(dá)。研究分級(jí)組裝支架修復(fù)顱骨缺損的效果及機(jī)制。結(jié)果顯示，MHCP 支架的推出力更高，新骨體積分?jǐn)?shù)更大，能更好地促進(jìn)骨再生，其通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞黏附和陽(yáng)離子運(yùn)輸?shù)葯C(jī)制實(shí)現(xiàn)高效骨修復(fù)。

圖 7. 分級(jí)組裝支架修復(fù)臨界尺寸顱骨缺損。

8.分級(jí)組裝支架自適應(yīng)骨再生過(guò)程
對(duì)植入分級(jí)組裝支架的兔顱骨缺損在不同時(shí)間點(diǎn)取材，通過(guò)組織學(xué)染色（H&E、Masson、ARS）和免疫熒光染色（CD44、Runx2、CD31、OPN 等）觀察骨再生各階段的細(xì)胞行為、組織變化和分子調(diào)控。研究分級(jí)組裝支架在骨再生不同階段的作用。結(jié)果表明，在骨再生早期，fHAp 促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化和干細(xì)胞招募；中期，支架引導(dǎo)組織長(zhǎng)入和早期成骨、血管生成；后期，支架完成使命，骨基質(zhì)重塑為致密新骨組織，實(shí)現(xiàn)了高質(zhì)量的骨再生。

圖 8. 分級(jí)組裝支架自適應(yīng)骨再生過(guò)程。

研究結(jié)論
本研究結(jié)合3D打印技術(shù)與超臨界CO₂發(fā)泡技術(shù)，通過(guò)有機(jī)-無(wú)機(jī)整合和表面成核生長(zhǎng)的方式，構(gòu)建了具有全再生周期調(diào)節(jié)能力的時(shí)空分級(jí)組裝支架。該支架將納米花狀fHAp作為骨愈合早期微環(huán)境的調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)，結(jié)合支架中結(jié)構(gòu)化HAp的時(shí)空釋放，增強(qiáng)了骨重塑過(guò)程，最終實(shí)現(xiàn)了臨界尺寸骨缺損的再生。這一成果為可降解骨修復(fù)材料的結(jié)構(gòu)和功能設(shè)計(jì)提供了新的研究思路，有望推動(dòng)骨修復(fù)領(lǐng)域的發(fā)展，為臨床治療骨缺損相關(guān)疾病提供更有效的解決方案。

文章來(lái)源：https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.162437