雙仿生策略，3D打印支架攜手外泌體增強(qiáng)成骨

來(lái)源：EngineeringForLife

大量段骨缺損是臨床上的難題，常導(dǎo)致不愈合、植入物失敗等問(wèn)題。傳統(tǒng)的Ti-6Al-4V骨植入物缺乏促進(jìn)骨再生所需的松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)和促血管生成信號(hào)。近日，來(lái)自南方醫(yī)科大學(xué)黃文華教授、胡孔和、吳耀彬團(tuán)隊(duì)聯(lián)合暨南大學(xué)Shiyu Li共同設(shè)計(jì)了一種結(jié)合3D打印技術(shù)和微流控技術(shù)的雙仿生策略，通過(guò)制備3D打印鈦合金支架（BTPS）與負(fù)載缺氧誘導(dǎo)外泌體的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠微球（PGHExo），有效解決了傳統(tǒng) Ti-6Al-4V骨植入物的應(yīng)力屏蔽和生物活性有限的問(wèn)題，顯著增強(qiáng)了體外的成骨和血管生成能力，并在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中提高了骨量、骨密度和新生血管化，為臨床骨缺損修復(fù)提供了有前景的解決方案（圖1）。相關(guān)研究成果以“3D-Printed Titanium Trabecular Scaffolds with Sustained Release of Hypoxia-Induced Exosomes for Dual-Mimetic Bone Regeneration”為題于2025年5月11日發(fā)表在《Advanced Science》上。

圖1 用于大骨缺損修復(fù)的BTPS&pDA@PGHExo支架的制造過(guò)程和治療機(jī)制的示意圖

1.BTPS的設(shè)計(jì)、制造和表征
作者首先描述了生物仿生松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)（BTPS）的設(shè)計(jì)、制造和表征過(guò)程。作者利用沃羅諾伊算法結(jié)合影像數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)出模仿股骨松質(zhì)骨解剖結(jié)構(gòu)的BTPS，其具有600微米的孔徑和70%的孔隙率，展現(xiàn)出各向異性和相互連通的多孔結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了與自然骨結(jié)構(gòu)的高度相似性。通過(guò)選擇性激光熔化（SLM）技術(shù)成功制造了這種具有生物仿生多孔松質(zhì)骨設(shè)計(jì)的Ti-6Al-4V支架（圖2A）。對(duì)BTPS的結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行了全面評(píng)估，SEM成像顯示BTPS表面光滑、孔壁厚度均勻（圖2B、C），EDS驗(yàn)證了該支架主要由鈦（Ti）、鋁（Al）和釩（V）組成（圖2D）；工業(yè)CT掃描驗(yàn)證了內(nèi)部完整性和連通性，孔徑分析顯示平均孔徑為560微米，平均松質(zhì)骨厚度為248微米（圖2E-J）。結(jié)果表明BTPS實(shí)現(xiàn)了預(yù)期的結(jié)構(gòu)精度和均勻性，其彈性模量約為3.2 GPa，滲透率為11.52 × 10⁻⁸ mm²，與自然骨的力學(xué)性能和滲透性相匹配。

圖2 BTPS的表征和元素映射

2.BTPS的有限元分析、力學(xué)測(cè)試和流體動(dòng)力學(xué)分析
進(jìn)一步，作者對(duì)BTPS進(jìn)行有限元分析、力學(xué)測(cè)試和流體動(dòng)力學(xué)分析的過(guò)程。通過(guò)有限元分析評(píng)估了BTPS在受載情況下的力學(xué)穩(wěn)定性，結(jié)果顯示最大應(yīng)力為454.26 MPa，應(yīng)力分布均勻，最大位移為0.005 mm，表明BTPS具有良好的變形抗力（圖3A-C）。流體動(dòng)力學(xué)評(píng)估了BTPS的滲透性和流體傳輸特性，結(jié)果顯示BTPS內(nèi)流速均勻，流體順暢通過(guò)孔隙結(jié)構(gòu)，無(wú)湍流或停滯現(xiàn)象，滲透率為11.52 × 10⁻⁸ mm²，表明其具有較高的流體傳輸能力（圖3D-H）。物理力學(xué)測(cè)試進(jìn)一步驗(yàn)證了BTPS的力學(xué)性能，其彈性模量為3.2 GPa，與松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的彈性模量范圍相符，且平均屈服壓縮載荷為3085.25 N，表明BTPS具有足夠的力學(xué)強(qiáng)度以支持骨組織修復(fù)和維持結(jié)構(gòu)完整性（圖3I-L）。

圖3 BTPS的力學(xué)特性、有限元和流體動(dòng)力學(xué)分析

3.外泌體的提取及表征
接著，作者從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中提取外泌體并對(duì)其進(jìn)行了表征。通過(guò)多步高速離心法成功提取了常氧和缺氧條件下的HUVECs來(lái)源的外泌體（圖4A）。免疫熒光染色顯示缺氧顯著提高了HUVECs中VEGFA的表達(dá)（圖4B）。定量分析表明，缺氧外泌體（Hypo-Exos）的蛋白濃度顯著高于常氧外泌體（圖4C）。蛋白印跡分析進(jìn)一步驗(yàn)證了外泌體標(biāo)記物ALIX、CD9和CD81的存在，證實(shí)了外泌體的純度和身份（圖4D）。TEM表明外泌體呈現(xiàn)典型的圓形形態(tài)，平均直徑約為100納米（圖4E）。納米顆粒跟蹤分析（NTA）顯示Hypo-Exos的顆粒濃度高于常氧外泌體，但兩者在100-150納米范圍內(nèi)的粒徑分布相似（圖4F）。隨著時(shí)間推移，PKH26標(biāo)記的外泌體被受體細(xì)胞攝取，其中Hypo-Exos在72小時(shí)的攝取量顯著更高（圖4G）。此外，研究還發(fā)現(xiàn)Hypo-Exos在50-200 μg mL⁻¹的濃度范圍內(nèi)具有劑量依賴性的促血管生成潛力，其中200 μg mL⁻¹組表現(xiàn)出最顯著的血管結(jié)構(gòu)形成（圖4H-I）。

圖4 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源外泌體的分離、鑒定和生物活性評(píng)價(jià)

4.雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠緩釋微球的制備、表征和釋放特性
隨后，作者通過(guò)微流控芯片技術(shù)成功制備了負(fù)載缺氧誘導(dǎo)外泌體（Hypo-Exos）的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠微球（PGHExo），并對(duì)其進(jìn)行了表征。作者發(fā)現(xiàn)PGHExo微球表面光滑、內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻，粒徑分布集中且平均粒徑約為80微米（圖5A、C、D）。流變學(xué)分析表明，與單組分GelMA凝膠相比，PEGDA/GelMA雙網(wǎng)絡(luò)凝膠具有更高的儲(chǔ)能模量和損耗模量，顯示出更好的力學(xué)穩(wěn)定性（圖5B）。在蛋白釋放特性方面，不含Hypo-Exos的PG樣本在18天內(nèi)幾乎無(wú)蛋白釋放，而含Hypo-Exos的樣本則表現(xiàn)出持續(xù)的蛋白釋放，且釋放速率與Hypo-Exos濃度正相關(guān)（圖5E）。特別地，PGHExo2（含2 mg mL⁻¹ Hypo-Exos）在18天內(nèi)持續(xù)釋放，平均釋放濃度約200 μg mL⁻¹，該濃度是誘導(dǎo)血管生成的最佳濃度（圖5F）。此外，通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察PKH26標(biāo)記的Hypo-Exos釋放情況發(fā)現(xiàn)，PGHExo2微球能持續(xù)釋放Hypo-Exos長(zhǎng)達(dá)18天（圖5G），免疫熒光成像和定量熒光分析結(jié)果一致，證實(shí)了雙網(wǎng)絡(luò)微球中有效的Hypo-Exo釋放（圖5H）。

圖5 負(fù)載HypoExos的PEGDA/GelMA雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠緩釋微球的制備、表征和釋放特性

5.BTPS&pDA@PGHExo的體外生物活性評(píng)估
作者在此部分主要描述了BTPS&pDA@PGHExo復(fù)合材料的制備過(guò)程及其體外生物活性評(píng)估。通過(guò)等離子體處理和多巴胺涂層（pDA）修飾將PGHExo微球固定在BTPS表面，形成穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)（圖6A-D）。SEM和EDS確認(rèn)了pDA涂層的成功修飾以及PGHExo微球在BTPS表面的良好分布（圖6E-H）。細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)表明，BTPS&pDA@PGHExo組展現(xiàn)出顯著更高的細(xì)胞活力和增殖能力（圖6I-K，L）。此外，該復(fù)合材料還顯著提升了MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化能力，表現(xiàn)為更高的堿性磷酸酶（ALP）活性和礦化結(jié)節(jié)形成能力（圖6M-O）。同時(shí)，BTPS&pDA@PGHExo組在促血管生成方面表現(xiàn)出色，表現(xiàn)為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等促血管生成基因的顯著上調(diào)（圖6P-W）。

圖6 BTPS和pDA@PGHExo的開(kāi)發(fā)、表征和功能評(píng)估

6.mRNA測(cè)序分析
基于其體外良好的生物活性，作者進(jìn)一步對(duì)BTPS&pDA@PGHExo進(jìn)行了mRNA測(cè)序分析，以探究其對(duì)基因表達(dá)的影響。與對(duì)照組相比，BTPS&pDA@PGHExo處理組中有5102個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，6049個(gè)基因表達(dá)下調(diào)（圖7A-D）。GO富集分析揭示了關(guān)鍵的生物學(xué)過(guò)程，如線粒體功能、骨形態(tài)發(fā)生和缺氧誘導(dǎo)的血管生成（圖7E-G）。KEGG通路分析則突出了包括MAPK、mTOR、HIF-1和VEGF在內(nèi)的關(guān)鍵信號(hào)通路，這些通路是成骨和血管生成的重要調(diào)控者（圖7H）。通過(guò)熱圖分析，作者進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了與骨功能相關(guān)的顯著基因（如ALPL、COL18A1、SAMD6和RUNX2OS1）以及與血管生成相關(guān)的基因（如VEGFB、PDGFA和ANGPT2）。為了驗(yàn)證RNA測(cè)序結(jié)果，作者對(duì)關(guān)鍵的成骨和血管生成差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行了定量實(shí)時(shí)PCR（qRT-PCR）分析（圖7I,J），結(jié)果表明BTPS&pDA@PGHExo組中RUNX2、OCN、PDGF和VEGF的蛋白表達(dá)水平顯著增加（圖7K-N）。

圖7 基因表達(dá)的mRNA-seq分析

7.體內(nèi)骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用效果
最后，作者對(duì)該復(fù)合材料在體內(nèi)骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用效果進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。作者在兔股骨缺損模型中植入了四種不同類型的支架（空對(duì)照組、BTPS組、BTPS&pDA@PG組和BTPS&pDA@PGHExo組），并在術(shù)后4周和12周分別進(jìn)行了Micro-CT和組織病理學(xué)分析（圖8A-E）。結(jié)果顯示，BTPS&pDA@PGHExo組在新骨體積和密度方面顯著高于其他組，特別是在4周時(shí)新骨體積達(dá)到19.3 mm³，骨密度達(dá)到653.9 mg cm⁻³，12周時(shí)分別增加至28.1 mm³和717.1 mg cm⁻³（圖8B-E）。組織病理學(xué)分析（圖8F-I）進(jìn)一步揭示了BTPS&pDA@PGHExo組在缺損部位顯著促進(jìn)了新骨形成和更密集的血管網(wǎng)絡(luò)。早期（4周）便觀察到明顯的新生骨和血管，至12周時(shí)骨進(jìn)一步成熟且血管密度增加。定量分析表明，BTPS&pDA@PGHExo組在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的新骨體積和血管密度均顯著高于對(duì)照組。

圖8 兔股骨缺損模型中支架組間骨再生功效的體內(nèi)評(píng)估

綜上，本文開(kāi)發(fā)了一種雙仿生策略，將3D打印的生物仿生松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)（BTPS）與負(fù)載缺氧誘導(dǎo)外泌體（Hypo-Exos）的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠微球（PGHExo）相結(jié)合，用于骨組織修復(fù)。通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，這種復(fù)合支架能夠顯著增強(qiáng)成骨和血管生成能力，調(diào)控關(guān)鍵信號(hào)通路（如MAPK、mTOR、HIF-1和VEGF），從而促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。在兔股骨缺損模型中，BTPS&pDA@PGHExo組展現(xiàn)出顯著的骨再生和血管化效果，表明該材料有望成為一種臨床應(yīng)用的骨缺損修復(fù)解決方案。

參考資料：
https://doi.org/10.1002/advs.202500599