中國人民解放軍總醫(yī)院：3D 生物打印 M2 巨噬細(xì)胞外囊泡模擬物促進(jìn)血管再生

來源：EFL生物3D打印與生物制造

3D生物打印組織移植物在再生醫(yī)學(xué)中具有廣闊前景，但其臨床轉(zhuǎn)化面臨兩大核心挑戰(zhàn)：一是植入后引發(fā)的異物反應(yīng)（FBR），導(dǎo)致纖維包膜形成和炎癥持續(xù)，阻礙移植物與宿主組織整合；二是血管化不足，造成移植物缺氧和功能障礙。研究表明，生物材料的剛度會(huì)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向促炎的M1表型極化，加劇FBR，而傳統(tǒng)細(xì)胞療法存在存活難、倫理風(fēng)險(xiǎn)及成本高等問題。   

為解決上述難題，中國人民解放軍總醫(yī)院的付小兵院士、杜曉輝主任和黃沙教授開發(fā)了一種基于M2巨噬細(xì)胞源細(xì)胞外囊泡模擬物（M2-EVMs）的創(chuàng)新策略。團(tuán)隊(duì)通過膜擠壓技術(shù)制備了M2-EVMs，將其作為生物墨水添加劑融入3D打印支架中，利用M2-EVMs抑制M1極化、促進(jìn)M2極化及血管生成的特性，減輕FBR并增強(qiáng)組織再生能力。在皮下植入和皮膚傷口模型中，搭載M2-EVMs的3D打印支架顯著減少了纖維包膜厚度，提升了血管密度和傷口愈合效率，展現(xiàn)出良好的生物相容性和再生效果。   

相關(guān)工作以“Bioprinted M2 macrophage-derived extracellular vesicle mimics attenuate foreign body reaction and enhance vascularized tissue regeneration”為題發(fā)表在《Biofabrication》上。

圖 1. 巨噬細(xì)胞源細(xì)胞外囊泡模擬物（EVMs）作為生物墨水添加劑用于抑制異物反應(yīng)（FBR）和促進(jìn)再生。

研究內(nèi)容
1. 3D生物打印支架剛度對(duì)異物反應(yīng)的影響，通過皮下植入不同剛度的3D生物打印支架，結(jié)合H&E染色、免疫熒光及轉(zhuǎn)錄組測序，研究支架剛度與異物反應(yīng)（FBR）及巨噬細(xì)胞極化的關(guān)系。結(jié)果表明，硬支架（Young’s模量0.285 MPa）顯著誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化（CD86+比例達(dá)80%），纖維包膜厚度（164.7±44.2 µm）是軟支架的3倍，且促炎基因（如IL-6、TLR4）顯著上調(diào)，證實(shí)剛度通過加劇M1極化惡化FBR。      

圖2. 3D生物打印支架剛度與異物反應(yīng)及巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)性。   

2. M2巨噬細(xì)胞源細(xì)胞外囊泡模擬物（M2-EVMs）的制備與表征，利用膜擠壓技術(shù)結(jié)合超聲破碎和梯度離心，制備了M1/M2-EVMs，并通過HR-TEM、NTA及蛋白質(zhì)印跡分析其結(jié)構(gòu)和成分。結(jié)果顯示，M2-EVMs呈圓形囊泡結(jié)構(gòu)（粒徑約100 nm），高表達(dá)M2標(biāo)記蛋白（如CD206、Arg1），低表達(dá)促炎蛋白（如TLR4），且能被成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞有效攝�。�6 h內(nèi)攝取率>70%）。      

圖3. M2-EVMs的制備流程及形態(tài)、成分表征。   

3. M2-EVMs對(duì)體外細(xì)胞行為的調(diào)控作用，通過劃痕實(shí)驗(yàn)、管形成實(shí)驗(yàn)及RT-qPCR，研究了M2-EVMs對(duì)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的功能影響。結(jié)果表明，M2-EVMs顯著抑制成纖維細(xì)胞活化（α-SMA表達(dá)降低50%）和遷移，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成（管形成數(shù)量增加80%），并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型極化（CD206+比例從10%升至45%），而M1-EVMs作用相反。      

圖5. M2-EVMs對(duì)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的體外調(diào)控作用。   

4. 生物墨水特性與EVMs釋放行為，通過流變學(xué)測試、SEM及釋放曲線分析，研究了含EVMs的明膠-海藻酸鹽水凝膠墨水的打印適性和釋放特性。結(jié)果表明，EVMs添加未顯著改變墨水的剪切變稀特性（黏度≈1000 mPa·s）和機(jī)械性能（Shore A硬度18.8-19.1°），且能在72 h內(nèi)持續(xù)釋放（累積釋放率≈80%），均勻分布于支架孔隙中。      

圖6. 含M2-EVMs的生物墨水特性及釋放行為分析。

5. 含M2-EVMs的3D生物打印支架的體內(nèi)性能評(píng)估，通過皮下植入和全層皮膚傷口模型，結(jié)合H&E染色、Masson染色及免疫熒光，研究了M2-EVMs對(duì)FBR和組織再生的影響。結(jié)果顯示，搭載M2-EVMs的硬支架纖維包膜厚度僅26.7±7.6 µm（較對(duì)照組降低58%），血管密度增加3倍，傷口愈合率提升40%，并促進(jìn)毛囊和血管再生，而M1-EVMs組炎癥反應(yīng)加劇。      

圖 7. M1 - 和 M2-EVMs 對(duì)皮下植入模型中異物反應(yīng)及巨噬細(xì)胞極化的影響。

圖 8. M1 和 M2 巨噬細(xì)胞來源的 EVMs 對(duì)皮下植入模型中膠原沉積和血管生成的影響。

圖 9. M1 - 和 M2-EVMs 對(duì)傷口治療模型中傷口愈合的影響。

研究結(jié)論
本研究開發(fā)了一種基于M2巨噬細(xì)胞源細(xì)胞外囊泡模擬物（M2-EVMs）的3D生物打印策略，以解決3D打印組織移植物的異物反應(yīng)（FBR）和血管化不足問題。通過膜擠壓技術(shù)制備的M2-EVMs可抑制巨噬細(xì)胞向促炎M1表型極化，促進(jìn)血管生成相關(guān)因子分泌，并有效被成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞攝取。將其作為生物墨水添加劑融入明膠-海藻酸鹽支架后，未顯著改變墨水的機(jī)械性能和打印適性，且能持續(xù)釋放（72 h累積釋放率≈80%）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，搭載M2-EVMs的支架可使纖維包膜厚度降低58%，血管密度增加3倍，顯著促進(jìn)皮膚傷口的上皮化、毛囊再生及血管形成。本研究證實(shí)M2-EVMs通過調(diào)控免疫微環(huán)境和促進(jìn)血管化，顯著提升了3D打印組織的宿主整合能力，為解決生物材料植入后的炎癥和再生難題提供了新途徑。

文章來源：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/add49f