3D 打印微球 - 水凝膠支架模擬肽促進骨再生中的神經(jīng)再支配修復(fù)

來源：EFL生物3D打印與生物制造

骨再生和重塑過程中，神經(jīng)再支配至關(guān)重要，但骨組織工程中神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建仍是挑戰(zhàn)，導(dǎo)致成骨受限。神經(jīng)生長因子（NGF）在骨愈合早期引導(dǎo)神經(jīng)支配，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）在骨愈合過程中持續(xù)表達并誘導(dǎo)成骨分化，但天然生長因子存在穩(wěn)定性差、劑量高、成本高等問題，且神經(jīng)營養(yǎng)因子與成骨相關(guān)生長因子的持續(xù)共遞送及神經(jīng)調(diào)控骨再生的機制研究較少。   

來自中山大學(xué)深圳校區(qū)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院的張超教授團隊與南方醫(yī)科大學(xué)材料研究中心的廖立瓊教授團隊合作，設(shè)計并構(gòu)建了一種3D打印微球-水凝膠支架，通過聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）微球包封BMP-2模擬肽、水凝膠基質(zhì)負載NGF模擬肽，實現(xiàn)了NGF模擬肽的快速釋放和BMP-2模擬肽的長期緩釋。該支架通過可編程釋放生長因子模擬肽，促進神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建和骨再生，并深入探究了神經(jīng)-骨串擾的分子機制。相關(guān)工作以“3D Printed Microsphere〩ydrogel Scaffold Facilitates Restoration of Reinnervation in Bone Regeneration through Programmable Release of NGF/BMP-2 Mimetic Peptides”為題發(fā)表在《Advanced Healthcare Materials》上。

基于時間域的雙模擬肽負載結(jié)構(gòu)體的構(gòu)建及神經(jīng)化骨再生過程。

研究內(nèi)容
1. 墨水流變性能與支架表征，通過流變測試（剪切速率、溫度、頻率對粘度及模量的影響）、掃描電子顯微鏡（SEM）觀察、釋放曲線測定及力學(xué)性能測試等方法，研究了含GelMA、mPGA及PLGA微球的打印墨水特性及3D打印支架性能。結(jié)果表明，墨水呈非牛頓流體剪切變稀特性，20°C時粘度適宜打印，支架結(jié)構(gòu)完整、孔隙清晰，PLGA微球均勻分散于絲材中；NGF模擬肽3天累計釋放82.94±6.75%，BMP-2模擬肽通過微球-水凝膠靜電作用實現(xiàn)8周74.31±3.86%持續(xù)釋放，壓縮強度和腫脹率分別達優(yōu)化水平，4周水解失重約11.51±2.58%。   

圖1. 墨水流變性能與支架表征。   

2. 體外神經(jīng)分化能力   通過PC12細胞（腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞）神經(jīng)突分化染色、RSC96細胞（施萬細胞）Transwell遷移實驗及免疫熒光定量分析，研究了支架提取物對神經(jīng)細胞的作用。結(jié)果顯示，含NGF模擬肽的B-N+和B+N+組誘導(dǎo)PC12細胞形成長軸突（神經(jīng)突長度顯著增加），神經(jīng)突陽性細胞比例提升；B+N+組RSC96細胞遷移數(shù)量最多，證實NGF模擬肽快速釋放可加速神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成，BMP-2模擬肽亦有協(xié)同促進作用。   

圖2. 體外神經(jīng)促進能力。   

3. 體外成骨分化能力   通過BMSCs與DRGs（背根神經(jīng)節(jié)）共培養(yǎng)體系，結(jié)合ALP染色、茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色及RT-qPCR檢測，研究了支架對成骨分化的影響。結(jié)果表明，B+N+組ALP活性最高，鈣結(jié)節(jié)沉積量顯著多于其他組，成骨基因ALP、OCN、Col I表達水平上調(diào)，且依賴CGRP（降鈣素基因相關(guān)肽）介導(dǎo)的AMPK-CREB1信號通路，而RUNX2表達主要受BMP-2模擬肽調(diào)控。   

圖3. DRGs存在下的體外成骨分化潛力。   

4. 突觸囊泡胞吐效應(yīng)分析   通過FM1-43熒光標記DRGs（背根神經(jīng)節(jié)）內(nèi)感覺神經(jīng)元的突觸囊泡，實時觀察NGF模擬肽對囊泡胞吐的影響。結(jié)果顯示，加入NGF模擬肽后，DRGs熒光強度在3分鐘內(nèi)顯著下降，表明突觸囊泡釋放速率加快，而BMP-2模擬肽對囊泡活性無明顯影響。該實驗證實NGF模擬肽通過促進神經(jīng)遞質(zhì)快速分泌，啟動神經(jīng)-骨串擾的早期信號傳導(dǎo)。   

圖4. NGF模擬肽對DRGs突觸囊泡胞吐的影響。   

5. 神經(jīng)-骨串擾分子機制   通過ELISA檢測CGRP濃度、Western blotting分析信號蛋白，研究了NGF模擬肽調(diào)控成骨的機制。結(jié)果顯示，NGF模擬肽顯著提升DRGs培養(yǎng)上清中CGRP濃度，激活A(yù)MPK和CREB1磷酸化，進而上調(diào)成骨轉(zhuǎn)錄因子SP7；抑制AMPK（Compound C處理）可阻斷該通路，證實其通過CGRP-AMPK-CREB1-SP7軸促進成骨，與BMP-2模擬肽的Smad通路形成協(xié)同。   

圖5. 神經(jīng)-骨串擾的潛在分子機制。   

6. 體內(nèi)骨再生與神經(jīng)再支配評估   通過大鼠顱骨5mm臨界缺損模型，結(jié)合Micro-CT三維重建、H&E染色、Masson三色染色及β-tubulin/OCN免疫熒光，研究了支架的體內(nèi)療效。結(jié)果顯示，8周時B+N+組BV/TV（骨體積/總體積）和Tb.Th（骨小梁厚度）最高，Tb.Sp（骨小梁間距）最小，新生骨與宿主骨整合緊密，β-tubulin陽性神經(jīng)纖維侵入缺損中心，OCN陽性成骨區(qū)域顯著擴大，表明雙因子協(xié)同促進神經(jīng)-骨再生耦合。   

圖6. 骨修復(fù)能力的Micro-CT分析。   

7. 組織學(xué)與免疫熒光分析  通過H&E染色觀察炎癥反應(yīng)、Masson染色評估膠原纖維生成及β-tubulin/OCN雙標染色定位神經(jīng)-骨界面，研究了支架的生物相容性和再生微環(huán)境。結(jié)果顯示，各組均無明顯炎癥，B+N+組8周時可見大量成熟膠原纖維沿支架孔隙排列，β-tubulin陽性神經(jīng)纖維密度最高，OCN陽性礦化區(qū)域覆蓋缺損中心，驗證了神經(jīng)再支配對骨再生的引導(dǎo)作用。   

圖7. 成骨與神經(jīng)生成的組織學(xué)分析。   

8. 神經(jīng)與骨相關(guān)蛋白定量分析   通過免疫熒光染色定量β-tubulin陽性神經(jīng)區(qū)域和OCN陽性骨組織面積，研究了支架對神經(jīng)-骨耦合的調(diào)控效果。結(jié)果表明，B+N+組β-tubulin陽性面積較對照組增加約2倍，OCN陽性面積提升3倍以上，證實NGF/BMP-2模擬肽共遞送可同步增強神經(jīng)纖維侵入和成骨活性，實現(xiàn)類生理條件下的骨愈合微環(huán)境重建。   

圖8. 神經(jīng)與骨陽性區(qū)域的定量分析。

研究結(jié)論
本研究成功設(shè)計并構(gòu)建了一種負載雙NGF/BMP-2模擬肽的3D打印支架。體外實驗表明，該支架快速釋放的NGF模擬肽可促進PC12細胞神經(jīng)分化及RSC96細胞遷移，模擬了骨痂形成過程中NGF的時序釋放特征；而持續(xù)釋放的BMP-2模擬肽可有效促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。機制研究發(fā)現(xiàn)，NGF模擬肽通過加速突觸囊泡釋放CGRP，激活A(yù)MPK-CREB1信號通路，與BMP-2模擬肽的Smad通路協(xié)同增強成骨分化。體內(nèi)實驗證實，該支架可促進宿主神經(jīng)纖維侵入缺損部位，重建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，進而顯著提升新骨再生效率。綜上，本研究開發(fā)的3D打印微球-水凝膠支架通過模擬天然生長因子的時序釋放模式，為骨組織工程中神經(jīng)化骨再生提供了一種有前景的策略。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/adhm.202501594