3D同軸打印還原氧化石墨烯氣凝膠基生物相容性纖維用于周圍神經(jīng)再生

來源：EFL生物3D打印與生物制造

周圍神經(jīng)（PN）缺損影響約3%的創(chuàng)傷患者，年新增臨床病例約9萬例，長缺損常需臨床干預(yù)，雖自體神經(jīng)移植（ANT）是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但存在二次創(chuàng)傷、炎癥等副作用，效果受限。人工神經(jīng)引導(dǎo)纖維（NGFs）雖有潛力，但現(xiàn)有多孔纖維存在孔徑大（>100 μm）、孔隙率低（<55%）、結(jié)構(gòu)無序等問題，難以滿足神經(jīng)再生所需的20-70 μm孔徑和>90%孔隙率要求，且機(jī)械性能與生物相容性不足。

來自蘭州大學(xué)張強(qiáng)強(qiáng)、王記增團(tuán)隊聯(lián)合中國人民解放軍總醫(yī)院唐佩福院士團(tuán)隊合作，開發(fā)了一種基于三維同軸打印技術(shù)的還原氧化石墨烯（rGO）氣凝膠基生物相容性纖維。團(tuán)隊通過同軸打印粘彈性GO墨水和海藻酸鈉（SA）凝膠，結(jié)合聚己內(nèi)酯（PCL）和褪黑素（Mel）原位沉積，構(gòu)建了具有軸向空心通道和徑向分級多孔結(jié)構(gòu)的rGO/PCL/Mel雜化氣凝膠纖維。該纖維孔隙率高達(dá)98.5%±0.24%，彈性模量7.06-26.58 MPa，兼具導(dǎo)電性、生物相容性和機(jī)械韌性，能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞黏附、增殖和有序遷移。在15 mm長神經(jīng)缺損的SD大鼠模型中，其神經(jīng)修復(fù)和肌肉功能恢復(fù)效果與自體神經(jīng)移植相當(dāng)。相關(guān)工作以“3D Coaxially Printing rGO Aerogel-Based Biocompatible Fiber for Peripheral Nerve Regeneration”為題發(fā)表在《Advanced Fiber Materials》上。張靖翔（蘭州大學(xué)）、劉鐘陽（解放軍總醫(yī)院）、張陽（解放軍總醫(yī)院）、王靜（上海長征醫(yī)院）為本文共同第一作者，蘭州大學(xué)張強(qiáng)強(qiáng)教授、王記增教授和解放軍總醫(yī)院唐佩福院士為論文共同通信作者。

研究內(nèi)容
1. 纖維制備流程與再生機(jī)制示意圖，通過三維同軸打印技術(shù)結(jié)合原位沉積工藝的研究方法，研究了rGO/PCL/Mel多孔空心氣凝膠纖維的制備過程及周圍神經(jīng)缺損修復(fù)機(jī)制。結(jié)果表明，該纖維通過GO墨水與SA凝膠的同軸打印形成空心結(jié)構(gòu)，經(jīng)水熱處理和PCL/Mel修飾后，具備分級多孔網(wǎng)絡(luò)，可促進(jìn)神經(jīng)軸突定向生長和營養(yǎng)物質(zhì)運輸。      

圖1. 三維同軸打印rGO/PCL/Mel多孔空心氣凝膠纖維的制備及神經(jīng)再生機(jī)制示意圖。   

2. 流變性能與打印能力對比評估，通過動態(tài)流變測試、數(shù)值模擬和實驗觀察的研究方法，研究了GO墨水的剪切變稀行為、屈服應(yīng)力及同軸打印過程中的流動特性。結(jié)果表明，GO墨水在0.02 vol%乙二胺交聯(lián)下形成穩(wěn)定凝膠網(wǎng)絡(luò)，剪切速率達(dá)100 s⁻¹時粘度降至1 Pa·s，且通過優(yōu)化同軸針頭結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了GO墨水在微通道內(nèi)的連續(xù)填充，確保纖維結(jié)構(gòu)完整性。      

圖2. GO墨水的流變性能與同軸打印能力對比評估。   

3. 纖維結(jié)構(gòu)表征與性能分析，通過掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）和力學(xué)測試的研究方法，研究了rGO/PCL/Mel纖維的微觀結(jié)構(gòu)、孔隙率及機(jī)械性能。結(jié)果表明，-60℃冷凍處理的纖維平均孔徑為（67.04±12.28）×（21.58±3.91）μm²，孔隙率98.5%±0.24%，彈性模量隨PCL濃度從70 mg/mL增至120 mg/mL，從7.06±0.81 MPa提升至26.58±4.99 MPa，且可承受180°折疊和360°扭轉(zhuǎn)。      

圖3. rGO/PCL/Mel纖維的結(jié)構(gòu)表征與性能分析。   

4. 體內(nèi)外生物相容性評估，通過CCK-8細(xì)胞活性檢測、活/死染色和組織學(xué)分析的研究方法，研究了纖維對雪旺細(xì)胞的毒性及體內(nèi)組織反應(yīng)。結(jié)果表明，含1 wt% Mel的纖維組細(xì)胞活性較rGO/PCL組提升32%，且植入大鼠體內(nèi)4周后無明顯炎癥反應(yīng)，心、肝、腎等器官未見毒性，證實其良好的生物相容性。      

圖4. rGO/PCL/Mel纖維的體內(nèi)外生物相容性評估。   

5. 軸突再生與功能恢復(fù)評估，通過甲苯胺藍(lán)染色、免疫熒光染色和CatWalk系統(tǒng)的研究方法，研究了纖維在15 mm神經(jīng)缺損模型中的軸突再生效率及運動功能恢復(fù)情況。結(jié)果表明，rGO/PCL/Mel組再生軸突平均直徑4.98±2.24 μm，NF200和S100陽性表達(dá)面積分別達(dá)15.65%±0.98%和15.25%±1.36%，與自體神經(jīng)移植組無顯著差異，且術(shù)后12周坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）恢復(fù)至-24.08±9.43，接近自體移植水平。      

圖5. rGO/PCL/Mel纖維的軸突再生評估。   

6. 運動功能與靶器官恢復(fù)評估，通過肌肉濕重測量、Masson三色染色和統(tǒng)計學(xué)分析的研究方法，研究了纖維對腓腸肌萎縮的逆轉(zhuǎn)效果及功能恢復(fù)。結(jié)果表明，rGO/PCL/Mel組肌肉濕重比達(dá)0.59±0.02，肌肉纖維面積百分比73.65%±3.81%，平均纖維直徑35.21±9.9 μm，均顯著優(yōu)于rGO/PCL組，證實其通過結(jié)構(gòu)與化學(xué)修飾協(xié)同促進(jìn)神經(jīng)-肌肉功能重建。      

圖6. rGO/PCL/Mel纖維的運動功能與靶器官恢復(fù)評估。

研究結(jié)論
本研究開發(fā)了一種基于三維還原氧化石墨烯（rGO）氣凝膠的中空纖維，通過同軸打印粘彈性氧化石墨烯（GO）墨水和犧牲性海藻酸鈉（SA）凝膠，并原位沉積聚己內(nèi)酯（PCL）和褪黑素（Mel），構(gòu)建了具有軸向空心通道和徑向分級多孔結(jié)構(gòu)的rGO/PCL/Mel雜化纖維。該纖維孔隙率高達(dá)98.5%±0.24%，彈性模量為7.06±0.81 MPa至26.58±4.99 MPa，兼具優(yōu)異的生物相容性、導(dǎo)電性和機(jī)械韌性，可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞穩(wěn)定黏附、快速增殖和軸突有序遷移。在15 mm長神經(jīng)缺損的SD大鼠模型中，該纖維在神經(jīng)缺損修復(fù)和肌肉功能恢復(fù)方面表現(xiàn)出與自體神經(jīng)移植幾乎相同的效果。本研究表明，通過多尺度結(jié)構(gòu)調(diào)控和合理化學(xué)修飾的三維同軸打印rGO氣凝膠基生物纖維，為臨床治療長段周圍神經(jīng)缺損提供了一種有前景的方法。

文章來源：https://doi.org/10.1007/s42765-023-00352-x