適配組織粘彈性的生物3D打印墨水可調控負載細胞行為并增強生物學功能

來源：EngineeringForLife

3D生物打印技術通過將細胞精準包裹于凝膠相材料中進行定向沉積，既能構建具有定制幾何形態(tài)的復雜結構，又能為細胞提供必要的力學支撐。這一尖端技術在個性化醫(yī)療、藥物研發(fā)、類器官工程等領域展現(xiàn)出巨大潛力，未來或將成為醫(yī)療生物制造領域的關鍵產業(yè)。為優(yōu)化打印組織的功能性，需在打印過程及后續(xù)培養(yǎng)中全程調控細胞行為。目前研究主要通過優(yōu)化水凝膠可打印性，輔以載藥或添加活性因子等生化策略來增強細胞性能。但最新證據(jù)表明，調控水凝膠的剛度、孔隙率、表面粗糙度等力學特性，同樣能顯著影響細胞行為與生物學功能。開發(fā)兼具打印保真度與細胞功能性的生物材料，仍是擠出式3D生物打印領域的重要挑戰(zhàn)。


來自蘇州大學的李斌等團隊提出一種小分子介導動態(tài)交聯(lián)網絡的粘彈性水凝膠，其可通過精確調控粘彈特性模擬多種組織的力學性能。該水凝膠憑借高粘度與快速剪切稀化的獨特組合，在保持結構完整性的同時顯著降低擠出過程對細胞的損傷。其中模擬骨髓粘彈性的水凝膠通過整合素/p-FAK/Lamin/YAP信號通路，在3D培養(yǎng)中顯著促進骨髓間充質干細胞的增殖、鋪展、遷移及干性維持，并在體外和體內實驗中均展現(xiàn)出增強的骨再生效果。研究還揭示了粘彈性水凝膠介導成骨分化的分子機制，首次發(fā)現(xiàn)Wnt1與YAP在細胞核內共定位并相互作用的新現(xiàn)象。此外，通過復現(xiàn)與結腸癌、肺纖維化及肝癌相關的病理基質力學參數(shù)，該粘彈性水凝膠可成功構建疾病模型。這項工作為生物墨水設計建立了創(chuàng)新策略，通過將可調控粘彈性與生物功能相融合，為再生醫(yī)學與疾病建模提供了統(tǒng)一平臺，展現(xiàn)出廣闊的3D生物打印轉化前景。相關工作以題為“Tailored Hydrogels for 3D Bioprinting: Matching Tissue Viscoelasticity to Enhance Resident Cell Functionality”的文章發(fā)表在2025年05月19日的期刊《Advanced Functional Materials》。

【匹配組織粘彈性的水凝膠構建及其3D打印性能評估】

在本研究團隊前期工作中，開發(fā)了一種基于小分子的創(chuàng)新策略，可制備儲能模量（G′）與損耗模量（G″）獨立可調的粘彈性水凝膠。該體系由甲基丙烯?；髂z（GelMA）、苯硼酸修飾明膠（GP）和3,4-二羥基苯甲醛（DB）組成。在中性pH條件下，三者通過物理混合形成硼酸酯鍵與希夫堿鍵的動態(tài)交聯(lián)網絡，其快速解離-重組動力學主導水凝膠的損耗模量；而后續(xù)紫外光引發(fā)GelMA共價交聯(lián)則主要調控儲能模量。通過調整各組分配比，我們制備了五種粘彈性水凝膠（Gel1-Gel5），其模量參數(shù)可精準匹配肺、結腸、皮膚、骨髓及肝臟等組織的力學特性（圖1A）。目標組織的參考粘彈性參數(shù)通過文獻調研或流變測試獲得[27]，其中Gel1儲能模量最低（0.32 kPa），損耗因子（Tanδ）為0.15，與肺組織特征高度吻合；而Gel5儲能模量較高（2.05 kPa），損耗因子降至0.12，模擬了肝臟的力學特性。這些結果證實了該水凝膠構建策略在復現(xiàn)組織特異性力學參數(shù)方面的巨大潛力，為研究粘彈性及其變化對組織生理病理的影響提供了理想平臺。

圖1 匹配多組織黏彈性的水凝膠制備及其可打印性評估

【模擬骨髓粘彈性的水凝膠3D生物打印】

在擠出式3D生物打印中，追求高打印分辨率常以犧牲細胞活性為代價。尤其是針尖直徑與注射器內徑的巨大差異會產生顯著速度梯度，導致剪切應力峰值遠超生理水平，可能引發(fā)細胞變形、膜破裂甚至死亡。即使細胞存活，這種機械損傷也會影響后續(xù)培養(yǎng)中的活性和生物學功能?；谇捌谧C實10GP水凝膠的優(yōu)異打印性能，本文推測其快速剪切稀化特性可緩解擠出過程中的細胞損傷。為驗證該假設，本文將骨髓間充質干細胞（BMSCs）分別載入10GP與10G水凝膠，并對擠出后的支架細胞進行即時凋亡染色。結果顯示凋亡細胞主要分布在擠出絲狀體的邊緣區(qū)域，即水凝膠-針壁界面處（圖2A,B），證實細胞損傷確實源于流動水凝膠與靜止針壁間的速度差。

本文通過流式細胞術定量分析并設立空白對照組（排除基礎低活性干擾），選擇擠出后6小時檢測（避免長時間非培養(yǎng)環(huán)境導致的營養(yǎng)缺乏混雜效應）。對照組僅檢測到微量凋亡，而10G組凋亡率達23.94%，約為10GP組的兩倍（圖2C,E）。這一發(fā)現(xiàn)表明：盡管10GP初始粘度更高，但其快速剪切稀化能力可大幅降低水凝膠邊緣的局部粘度，有效潤滑針壁并提供細胞保護，從而減少擠出過程中的細胞損失。

圖2 10G與10GP3D打印中BMSCs的凋亡、活性及干性研究

【黏彈性水凝膠對細胞行為的調控研究】

本文將骨髓間充質干細胞（BMSCs）分別包封于10GP與10G水凝膠中培養(yǎng)3天。5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）染色及定量分析顯示，10GP組的BMSCs增殖率顯著高于10G組（圖3A,B），這表明10GP水凝膠可能為BMSCs的定植與擴增提供了更有利的微環(huán)境，從而加速組織構建進程。通過F-肌動蛋白熒光染色觀察細胞骨架排布發(fā)現(xiàn)，兩組細胞呈現(xiàn)明顯形態(tài)學差異：10G水凝膠中的BMSCs主要保持圓形形態(tài)且鋪展受限，而10GP組細胞則展現(xiàn)出廣泛的鋪展行為，形成顯著的細胞突起與片狀偽足，整體呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形（圖3C,D）。這種形態(tài)轉變可歸因于10GP水凝膠的仿生黏彈性特性，其增強了細胞-基質相互作用。核形態(tài)計量學分析進一步顯示，10GP組BMSCs的核面積顯著增大（圖3E）。這種核膨脹現(xiàn)象可能反映了細胞骨架重組和染色質重塑對水凝膠機械微環(huán)境的響應，進而潛在調控轉錄活性與細胞功能。

圖3 BMSCs在10G與10GP水凝膠中的細胞行為

【黏彈性水凝膠誘導的機械信號轉導通路】

具有仿生骨髓黏彈特性的水凝膠在促進細胞存活、干性維持、增殖、鋪展及遷移行為方面展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢。這些發(fā)現(xiàn)表明，精確模擬天然組織黏彈性可有效重建體外培養(yǎng)中細胞-細胞外基質（ECM）的關鍵相互作用。作為結構界面與核心機械信號轉導樞紐，細胞膜在ECM成分與胞內信號網絡間發(fā)揮關鍵中介作用——通過多種膜受體選擇性識別并處理ECM來源的機械刺激。其中，整合素作為跨膜連接器將細胞骨架與膠原等ECM蛋白相連，建立細胞感知-響應的核心機械轉導通路。整合素β1作為整合素β亞基家族基本成員，通過膜定位后的構象激活參與機械信號傳導，觸發(fā)級聯(lián)胞內信號事件以調控黏附、遷移及機械感知等過程。

為闡明整合素β1及其下游通路響應水凝膠黏彈性的作用機制，本文進行了免疫熒光染色實驗，發(fā)現(xiàn)10GP組整合素β1活化水平顯著升高，伴隨明顯的細胞鋪展與骨架重組（圖4A,B）。黏著斑激酶（FAK）作為整合素β1通路的關鍵信號介質，通過與整合素、紐蛋白形成黏著斑復合體，不僅橋接胞內骨架與ECM，更在調控細胞黏附遷移中發(fā)揮核心作用。對磷酸化FAK（p-FAK）和紐蛋白的熒光染色定量分析表明，10GP組水凝膠的黏性耗散特性可上調p-FAK水平（圖4C）并誘導更廣泛的紐蛋白分布（圖4D），提示其增強了黏著斑組裝與機械感知活性。

圖4 BMSCs在10G與10GP中的生物力學信號轉導機制

此外，本文探究了黏彈性水凝膠中機械信號轉導與細胞干性維持的關系。流式細胞術定量分析表明，抑制p-FAK會導致細胞干性標志物表達降低（圖5A）。同樣，抑制下游蛋白YAP也會引起這些標志物表達下降（圖5B）。這證實了本研究團隊前期的發(fā)現(xiàn)：黏彈性水凝膠支架能夠支持BMSCs干性的維持。總體而言，當在黏彈性水凝膠支架中培養(yǎng)時，BMSCs可將細胞膜接收的外部機械刺激轉化為生物信號，隨后通過整合素β1/p-FAK介導的機械信號轉導通路在細胞內傳遞。當核膜感知到來自支架的機械力時，核纖層蛋白A/C表達上調， YAP發(fā)生顯著的核轉位，進而調控細胞核活動以促進BMSCs干性的維持（圖5C）。

圖5 10GP中p-FAK與YAP對BMSCs干性的關聯(lián)性分析

【3D打印粘彈性水凝膠支架中BMSC的成骨分化研究】
基于對粘彈性水凝膠打印過程中剪切稀化特性及其維持細胞功能關鍵作用的闡釋，本文通過評估3D打印粘彈性水凝膠中BMSC的成骨分化潛能，進一步探究了其對組織再生的后續(xù)影響。將負載BMSC的水凝膠支架（10G、10GP）浸入成骨誘導培養(yǎng)基，以驗證特定環(huán)境下BMSC定向分化是否增強。培養(yǎng)7天后，10GP組的堿性磷酸酶（ALP）活性較10G組顯著升高（圖6A）。14天后的茜素紅染色顯示10GP組鈣結節(jié)數(shù)量更多（圖6B）。通過qRT-PCR分析兩組RNA發(fā)現(xiàn)，10GP組中Col1a1、Bglap、Runx2和Alpl基因表達均高于10G組。這些結果表明BMSC在體外粘彈性水凝膠支架中展現(xiàn)出更強的成骨分化潛能。

另外，本文發(fā)現(xiàn)：力學信號通過激活Wnt等多條信號通路，在調控BMSC成骨分化、骨骼發(fā)育與重塑中起關鍵作用。然而水凝膠粘滯耗散特性介導YAP核轉位的具體分子機制仍有待闡明。為此，本文以粘彈性水凝膠為力學傳導研究平臺，旨在發(fā)現(xiàn)潛在通路或靶點。具體而言，將BMSC接種于粘彈性水凝膠中，經成骨誘導培養(yǎng)7天后，以YAP抗體為誘餌從細胞裂解液中分離互作蛋白并進行質譜分析。排除干擾蛋白后，基因本體（GO）富集分析顯示這些蛋白主要參與三大生物學過程：細胞代謝調控、物質結合及蛋白質復合物組裝（圖6C）。同步進行的KEGG通路富集分析表明，與YAP互作的蛋白涉及"Wnt信號通路"、"真核生物核糖體生物合成"及"干細胞多能性調控通路"（圖6D），這些通路均有利于促進成骨。

圖6 打印10G與10GP支架中BMSCs的成骨分化潛能

【3D打印粘彈性水凝膠支架的骨缺損修復研究】

為評估負載BMSC的粘彈性水凝膠支架體內骨修復效果，本文采用大鼠顱骨缺損模型進行實驗。在健康大鼠顱骨手術制備直徑≈5 mm、深度2 mm的標準化缺損，并將打印水凝膠尺寸按比例縮小以匹配骨缺損模型（圖7A）。植入4周后的Micro-CT掃描顯示各組修復效果差異顯著：對照組缺損區(qū)未見新骨形成且仍存在明顯空隙；10G組僅出現(xiàn)零星分散的新骨組織；而10GP組則表現(xiàn)出優(yōu)異的成骨能力，缺損邊緣形成連續(xù)環(huán)形新骨組織且整合良好，呈現(xiàn)明顯的向心性生長模式。至第8周時，10GP組新骨組織已向缺損中心區(qū)域延伸，僅殘留極小未愈合區(qū)；雖然10G組較基線有所改善，但仍有超半數(shù)缺損未覆蓋，修復效果顯著劣于10GP組（圖7B）。通過骨體積分數(shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）及厚度（Tb.Th）的定量分析進一步證實，10GP組的骨再生能力顯著優(yōu)于10G組（圖7C）。

圖7 打印10G與10GP支架的骨缺損修復效果

【粘彈性水凝膠構建疾病模型的潛力研究】

基于前期研究，我們通過調整粘彈性水凝膠的組分濃度，成功模擬了三種非肌肉骨骼系統(tǒng)疾病相關組織的細胞外基質（ECM）力學特性：結腸癌、肺纖維化和肝癌。如圖8A所示，這些病理基質的儲能模量與損耗因子值均得到精確復現(xiàn)。三種水凝膠均表現(xiàn)出良好的可打印性，可負載相應細胞打印出模擬結腸隱窩的管狀結構、肺泡網絡的蜂窩狀圖案以及肝小葉構型的3D支架，用于體外疾病模型構建嘗試。在粘彈性結腸癌模型中，結腸癌細胞自發(fā)形成球狀細胞團簇結構，該現(xiàn)象與其他腫瘤類器官研究結果一致。作為細胞增殖的重要標志物，Ki-67已被證實與結腸癌進展呈正相關，并廣泛用于結腸癌類器官的活性表征。實驗顯示相較于GelMA水凝膠，粘彈性水凝膠中的細胞表現(xiàn)出更高水平的Ki-67表達（圖8B），表明該體系能促進結腸癌類器官的細胞增殖。

圖8 基于定制黏彈性水凝膠的病理力學微環(huán)境疾病模型構建

【總結與展望】
本研究通過動態(tài)交聯(lián)網絡制備了儲能模量與損耗模量可獨立調控的粘彈性水凝膠，結合生物打印技術構建高精度支架，成功開發(fā)出面向實際應用需求的生物墨水。通過精準匹配五種組織的粘彈性力學特征，并優(yōu)化水凝膠的初始黏度與剪切稀化特性，在保證打印精度的同時有效降低細胞損耗，一定程度解決了機械擠出式3D打印的關鍵難題。該粘彈性水凝膠在細胞活性、打印保真度和組織仿生性方面的突破，為深入理解細胞對粘彈性的響應及生物材料科學發(fā)展奠定了重要基礎。

參考資料：https://doi.org/10.1002/adfm.202503987