以“結構-性質(zhì)-功能”視角分析生物墨水增強策略

來源： EngineeringForLife

水凝膠作為一種高含水的三維高分子網(wǎng)絡，其在結構上模擬細胞外基質(zhì)，為細胞生長提供“支架”結構，是生物3D打印常用的墨水材料。作為載體材料，水凝膠的性質(zhì)決定了生物3D打印的成敗與質(zhì)量，其需要具有良好的可打印性并能為細胞生長提供適宜微環(huán)境。然而，普通水凝膠的交聯(lián)網(wǎng)不夠均勻且缺乏能量耗散機制使其機械性能較差，無法成為兼顧可打印性及生物相容性的“好用”生物墨水。

近期，美國德州農(nóng)工大學Akhilesh K. Gaharwar教授團隊在Advanced Materials上發(fā)表綜述文章：Hydrogel BioinkReinforcement for Additive Manufacturing: A Focused Review of Emerging Strategies。該文首先介紹生物墨水網(wǎng)絡結構如何影響其流變特性、機械強度以及生物學特性，接著重點綜述現(xiàn)有生物墨水增強機理及其對生物墨水關鍵性能的影響，最后給出了幾種有前景的下一代生物墨水設計方法。該綜述通過深入分析生物墨水“結構-性質(zhì)-功能”的關系來指導墨水設計，這種自下而上的視角為生物3D打印提供了以材料為中心的生物墨水設計思路。

一、生物墨水的基本特性
首先需要探討生物墨水的網(wǎng)絡結構、流變特性、生物力學和生化特性。這些特性以復雜的方式相互關聯(lián)，在優(yōu)化生物墨水性能時必須予以考慮。隨著研究深入，這些領域中某些因素已被認為對生物墨水性能至關重要（例如剪切稀化和彈性模量），一些因素仍在評估中（例如剪切恢復和應力松弛）。盡管這些因素在文獻中并未得到一致報道，但在物墨水設計時仍應重點研究。

圖1 生物墨水的網(wǎng)絡結構、流變特性、生物力學及生化特性在打印中的相互作用

1. 生物墨水的網(wǎng)絡結構
（1）交聯(lián)網(wǎng)絡
經(jīng)典的聚合物三維網(wǎng)絡通過兩種方式形成：a單體溶液的聚合和交聯(lián)；b現(xiàn)有聚合物交聯(lián)。兩種方法通常都包含密集和稀疏交聯(lián)區(qū)域的隨機分布，這種異質(zhì)性導致受力時局部應力集中，從而在聚合物網(wǎng)絡中形成較弱的破壞區(qū)域。因此，交聯(lián)點分布是決定聚合物網(wǎng)絡機械性能的關鍵。交聯(lián)度增加意味著異構網(wǎng)絡變多，這使水凝膠變硬、變脆，而低交聯(lián)度水凝膠表現(xiàn)為軟、韌。
（2）斷裂與能量耗散
當前的生物墨水文獻通常僅通過一些機械參數(shù)來表征凝膠，例如斷裂應變、應力以及壓縮、拉伸或剪切模量。這些參數(shù)固然重要，但僅部分描述了水凝膠的機械性能。對于比較聚合物網(wǎng)絡中的總體機械性能，特別有用的參數(shù)是斷裂能。

水凝膠與其他柔軟的聚合物網(wǎng)絡具有許多結構相似性，但它們的水合結構導致其機械性能在關鍵方面有所不同。在所有的軟聚合物網(wǎng)絡中，固有斷裂能取決于裂縫平面處聚合物鏈的長度、數(shù)量和鍵強度。交聯(lián)可增加彈性模量和拉伸強度，但會降低斷裂能和可延展性。這些因素一起嚴重限制了常規(guī)水凝膠的機械性能。


2. 生物墨水的流變特性和流動模型
（1）牛頓模型
通常在牛頓流體模型中對在打印條件范圍內(nèi)保持一致黏度的生物墨水進行建模，其中剪切速率（γ）等于剪切應力（τ）除以黏度（K）。但是，大多數(shù)用于擠出3D打印的生物墨水都是非牛頓流體，它們的表觀黏度取決于剪切速率或變形歷史。非牛頓效應通常是由于長聚合物鏈的重新取向和靜電相互作用的破壞而引起，這是增強型生物墨水的常見特征。

（2）冪模型
在剪切稀化的生物墨水中，增加剪切速率會迫使聚合物鏈沿流向?qū)�齊，從而降低表觀黏度。在較高剪切速率下靜電相互作用的破壞也降低了表觀黏度。剪切稀化特性對生物打印有益，因為打印過程中剪切應力較低，降低了對細胞的損傷。
模擬剪切稀化行為的最簡單方法是利用冪律關系（圖1），其中剪切應力（τ）與剪切速率（γ）通過流動行為指數(shù)（n）和稠度指數(shù)（K）得出。在該模型中，牛頓流體的n = 1，而n值<1則將呈現(xiàn)剪切稀化。冪模型對于在打印條件下的許多生物墨水非常有用。

（3）Herschel Bulkley模型
許多非牛頓生物墨水還表現(xiàn)出黏彈性，其特點是存在一個屈服應力。屈服應力是引發(fā)流動所需的最小應力。打印的保真度受屈服應力影響。可以通過在流動輪廓的中心產(chǎn)生活塞流，從而在擠出過程中使包封的細胞免受剪切力的影響，此時剪切力被限制在沿擠出機壁的狹窄區(qū)域內(nèi)。

高屈服應力使生物墨水難以使用，不利于移液和細胞分散操作。屈服應力的變化已在一系列生物墨水中被注意到，其可改善生物墨水的可打印性和細胞存活率。Herschel-Bulkley模型中τ0為屈服應力，低于此值，生物墨水將表現(xiàn)為固體。Herschel-Bulkley流體模型可以準確地描述出剪切稀化和屈服應力的非牛頓流體行為。

（4）Carreau方程
可以使用更復雜的模型來表征生物墨水的行為，如Carreau方程，該方程對于描述非常低和高剪切速率下生物墨水的不同流動行為特別有用。當剪切速率太低而無法克服聚合物鏈的隨機運動方向時，流體被視為具有恒定黏度的牛頓流體，而在中等剪切速率下則被視為冪流體。在較高的剪切速率下，它們再次變?yōu)榕ｎD流體。該模型最近用于表征聚丙交酯微纖維增強藻酸鹽生物墨水的流動行為。

（5）現(xiàn)有模型局限性
盡管現(xiàn)有的流動模型可以幫助預測打印過程中的生物墨水行為，但擠出后的剪切恢復變得很重要，但在這些模型中并未考慮在內(nèi)。

當前的流動模型對于結合實際實驗篩選潛在的生物墨水非常有用。最新研究表明，剪切稀化、屈服應力和快速剪切恢復是生物墨水可打印性的關鍵因素。

3. 生物墨水的生物力學特性
（1）宏觀尺度
宏觀上，生物3D打印的最終目標是植入人體，這使多數(shù)生物墨水難以達到相匹配的械性性能，包括剛度、黏彈性和屈服應力/應變。例如，軟組織植入物需要維持與周圍組織相似的壓縮水平，而不會被破壞或與周圍組織分離。在生物打印中，水凝膠在擠出后還必須能夠支撐自身，而不會出現(xiàn)明顯的塌陷或變形。

（2）細胞尺度
除了宏觀尺度，細胞感知尺度的機械性能在組織再生中也起著重要作用。彈性模量（或剛度）會深刻影響封裝細胞的行為，例如，間充質(zhì)干細胞（MSC）的基質(zhì)剛度依賴性分化。此外，更復雜的黏彈性能也顯著引導細胞行為。例如，與純彈性水凝膠相比，顯示出應力松弛的黏彈性水凝膠即使較軟也能促進成肌細胞增殖�？焖俚膽�力松弛會增加MSC的增殖、擴散和成骨分化。


4. 生物墨水的生理穩(wěn)定性和生化相互作用
水凝膠的生化環(huán)境涉及生物力學性能。例如，細胞可以通過整合素蛋白感知基質(zhì)的剛度，因此沒有整合素結合位點的水凝膠會減少細胞對基質(zhì)剛度的反應。另外，生物降解性是水凝膠設計中的重要因素。水凝膠將隨著時間的推移被再生組織取代，其降解速率應與組織再生速率相匹配。

二、現(xiàn)有生物墨水增強策略
早期3D打印水凝膠只是在機械性能和細胞相容性之間折衷。隨著生物3D打印技術的發(fā)展，已出現(xiàn)了許多增強型生物墨水材料。他們采用了例如聚合物功能化、超分子增強、納米復合材料等增強等方式。這些方法通過多種不同渠道改善了水凝膠的機械性能，包括加強交聯(lián)、使應力分布均勻以及通過犧牲鍵耗散機械能等。

圖2 水凝膠生物墨水增強方式

1. 聚合物功能化及雙交聯(lián)網(wǎng)絡
（1）甲基丙烯酸酯功能化
作為最廣泛使用的方法之一，甲基丙烯酸酯基團修飾聚合物在其主鏈上引入雙鍵，這使聚合物可在光引發(fā)劑存在下進行光交聯(lián)。例如，常用的甲基丙烯�；�明膠（GelMA）在維持明膠許多基本生物活性及溫敏性的同時賦予其光交聯(lián)性。光交聯(lián)的GelMA在體溫下穩(wěn)定，具有較高的斷裂能，更耐降解，并且可以通過選擇性曝光進行圖案化，用于光固化3D打印。甲基丙烯酸酯化也已應用于多糖，包括透明質(zhì)酸、殼聚糖、葡聚糖等。

（2）點擊化學及其他方法
點擊化學反應有高活性并且可在溫和的條件下進行的特點。其中最常見的為硫醇-雙鍵點擊化學反應。硫醇-雙鍵點擊反應為逐步增長反應，其不受氧的抑制且速率很高。這種快速交聯(lián)特性可通過在擠出的幾秒鐘之內(nèi)固化生物墨水來改善可打印性，從而減少結構下垂。

此外，還有用于生物墨水的非光交聯(lián)劑。例如，酪氨酸酶已被用作光引發(fā)劑的替代物，以催化膠原和明膠的交聯(lián)來增強生物墨水。

2.超分子生物墨水

圖3 超分子作用生物墨水機理

（1）主-客體作用
主-客體作用是一種可逆的動態(tài)鍵合方式，最常見的便是β-環(huán)糊精與金剛烷間的特異性結合�；�于主-客體作用的水凝膠具有剪切稀化及自愈合性能，這有利于擠出打印。盡管主-客作用具有特殊性質(zhì)，但是水會削弱主-客體間結合力，隨著時間的流逝，超分子部分容易受到蠕變和侵蝕的影響。此外，主-客體作用制備的凝膠往往機械性能較差，因此它經(jīng)常與共價鍵交聯(lián)結合使用。

（2）超分子作用
其他類型的超分子作用如氫鍵、π-π堆積、多肽及DNA類型的超分子水凝膠等。這些類型超分子作用由于其制備過程復雜或機械性能較難滿足3D打印需求因而研究較少。

3. 互穿網(wǎng)絡
互穿網(wǎng)絡（IPN）通過高度異質(zhì)的水凝膠結構提高了斷裂能、韌性和剛度。IPN由兩個單獨的聚合物網(wǎng)絡組成，這些聚合物網(wǎng)絡通過共價或離子交聯(lián)結合在一起（圖 4）。

圖4 基于互穿網(wǎng)絡的生物墨水原理圖

（1）離子-共價鍵糾纏網(wǎng)絡
在生物墨水中，最有常見IPN是通過離子-共價鍵糾纏（ICE）形成的。對于生物打印應用而言，傳統(tǒng)的共價鍵雙網(wǎng)絡水凝膠制備時間過長。ICE水凝膠由離子交聯(lián)的剛性聚合物和共價交聯(lián)的彈性聚合物形成。使用兩種不同的交聯(lián)機制大大減少了形成IPN所需的時間。

（2）雙重網(wǎng)絡
雙重網(wǎng)絡為兩個相互獨立的交聯(lián)網(wǎng)絡，一般為兩個網(wǎng)絡使用不同交聯(lián)方式，相互之間的交聯(lián)不干擾。與任一單獨組分網(wǎng)絡相比，雙網(wǎng)絡凝膠的機械性能表現(xiàn)的更為優(yōu)秀。

互穿網(wǎng)絡通過使用脆性犧牲網(wǎng)絡與可擴展第二網(wǎng)絡相結合，在較寬的損壞區(qū)域內(nèi)分配應力來提高機械性能。由于其交聯(lián)快速及可恢復的機械性能而被用于生物打印。物理交聯(lián)聚合物通常也是黏度調(diào)節(jié)劑，同時改善了可打印性。


4. 納米復合

圖5 納米復合增強水凝膠生物墨水

由于納米材料的高比表面積，即使用量很少也可以顯著影響水凝膠網(wǎng)絡的性能。納米材料的摻入已被用來向生物墨水添加新的功能，例如增強電導率、刺激響應能力、對細胞行為的控制、改善打印性和機械性。

常用的納米材料有石墨、碳納米管、納米粘土、磁性納米顆粒、過渡金屬二硫?qū)倩�物和聚合物納米顆粒等。增強機制可能會根據(jù)納米粒子的大小、形狀和表面化學性質(zhì)而有所不同。通常認為納米顆粒是通過充當跨越多個聚合物鏈的可逆交聯(lián)劑而增強水凝膠的。這樣可以使應力有效地分散到整個網(wǎng)絡中，并通過破壞納米粒子與聚合物間的交聯(lián)而耗散能量。應力分散避免了大范圍的裂紋擴展，這種機理已被證明可以提高水凝膠的強度和韌性。

三、下一代生物墨水增強策略

圖6 水凝膠生物墨水增強的前沿技術

1. 多組分生物墨水
顧名思義，將多種交聯(lián)、增強方式組合使用，進而獲得具有特殊性能的生物墨水。盡管各種增強方式實現(xiàn)過程不同，但是這些增強策略背后的機制并不是相互排斥的，往往可以與其他方法結合使用。組合使用后可以彌補各自缺點并整合不同增強機制的優(yōu)勢。


2. 滑動環(huán)交聯(lián)生物墨水
單網(wǎng)絡水凝膠的弱點之一是非均一的網(wǎng)絡結構，這導致應力集中在最短的鏈上。使用機械互鎖的分子，包括滑動環(huán)交聯(lián)體系，如聚輪烷等可有效避免應力集中。這些環(huán)動態(tài)地跨鏈滑動，在交聯(lián)點間均勻地分配應力，從而使水凝膠具有出色的可延展性和高斷裂強度。


3. 基于微凝膠的生物墨水
基于水凝膠微球的生物生物墨水格外引人注目。水凝膠微球密集堆積或填充于液體中，微球間的接觸面可發(fā)生交聯(lián)反應進而形成大塊凝膠。這種方法可控制孔隙率，從而創(chuàng)建高度互連的微孔支架，同時還可為細胞提供特殊的微環(huán)境。微球還可包載不同細胞，進而構建多細胞支架。然而，微球可打印性的影響因素仍然知之甚少。包括微球尺寸、多分散性、堆積密度、表面相互作用等。

總結
水凝膠生物墨水的生物學活性與機械性能通常比較矛盾。細胞的生長往往需要稀疏的交聯(lián)網(wǎng)絡以便養(yǎng)分傳輸，而強度和可打印性則需要更高的聚合物濃度。這些矛盾的需求推動了對更高級水凝膠結構的研究。常規(guī)的單網(wǎng)絡水凝膠因其不均勻的網(wǎng)絡結構而引起的應力集中，這削弱了凝膠的強度。將機能量耗散機制整合到水凝膠結構中可顯著提升凝膠機械性能。

隨著細胞行為與材料間相互作用的研究，生物墨水增強技術愈發(fā)重要。多種組合技術可能具有協(xié)同作用，微球生物打印和滑環(huán)交聯(lián)等新方法也正在被積極研究。

參考文獻：
[1] Chimene D, Kaunas R, Gaharwar AK. Hydrogel Bioink Reinforcementfor Additive Manufacturing: A Focused Review of Emerging Strategies [J]., 2020,32(1): 1902026.