《Small》：基于雙光子技術構建金字塔支架用于膠質(zhì)瘤培養(yǎng)

來源：EngineeringForLife

膠質(zhì)瘤是一類常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，患者預后較差，生存率低下。目前，對于膠質(zhì)瘤的治療尚無有效辦法，其中重要的原因是現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)手段難以保留膠質(zhì)瘤細胞在體內(nèi)微環(huán)境下的特征，進而限制了對膠質(zhì)瘤細胞的進一步認識。

微管形成的網(wǎng)絡骨架和表皮生長因子受體（EFGR）在膠質(zhì)瘤侵襲中具有重要作用，但是隨著細胞在二維環(huán)境中增殖傳代，EGFR復制和微管形成均受到抑制。三維培養(yǎng)更接近真實的體內(nèi)微環(huán)境，而有利于追蹤、檢測細胞生物學行為。

來自荷蘭代爾夫特理工大學Angelo Accardo教授團隊使用雙光子聚合技術（2PP）構建了一種新型的三維支架，可模擬體內(nèi)微環(huán)境用于培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞。

相關研究成果近日以題為“3D-Engineered Scaffolds to Study Microtubes and Localization of Epidermal Growth Factor Receptor in Patient-Derived Glioma Cells” 發(fā)表在《Small》上。

1. 三維支架的制備
支架的設計借鑒了體內(nèi)腫瘤細胞所處的微環(huán)境。膠質(zhì)瘤細胞在體內(nèi)易在血管分支處增殖、遷移、聚集。因此，作者設計了一種與血管網(wǎng)絡相似的多孔結構。作者使用2PP技術進行支架制備，支架的基本單元為立方體（50μm），中間伴有一個斜行連接桿，數(shù)個小的立方體再堆積形成一個金字塔結構（370μmx370μmx190μm）。空隙的大小要求略大于細胞核從而能促進細胞的遷移和物質(zhì)運輸，同時有利于形成蜂窩狀結構。

圖1 三維支架的制備

2. 三維支架上細胞的形態(tài)與結構
使用Tublin標記發(fā)現(xiàn)，標準細胞系（U-87）和四種患者來源的膠質(zhì)瘤細胞（GS-580, GS-827, GS-830, 和GS-921）均可成功定植在支架上。掃描電鏡顯示，定植的細胞可形成長突觸，并向立方體中央延伸。相比于二維環(huán)境，定植在三維支架上的細胞面積和細胞核面積均明顯減小，而細胞圓度兩者未見明顯差異。進一步對6個膠質(zhì)瘤樣本中的細胞進行測量分析發(fā)現(xiàn)，組織樣本和三維支架上的細胞核大小以及細胞核圓度均小于二維環(huán)境培養(yǎng)下的細胞核。因此，三維支架上培養(yǎng)的細胞在形態(tài)與結構上更接近于體內(nèi)情況。

圖2 三維支架上的細胞形態(tài)

3. 三維支架上細胞微管形態(tài)和EGFR分布
微管是細長的細胞突起，可以形成功能性蜂窩網(wǎng)絡結構，對于促進腫瘤侵襲具有重要作用。

三維支架上的細胞可見長而多的細胞突起，且在納米層面可見。進一步使用GAP-43標記微管蛋白，研究顯示，相比于二維培養(yǎng)，三維支架中的微管更短，更細。

EGFR是膠質(zhì)瘤中常見的受體之一，進一步分析細胞EGFR的分布情況發(fā)現(xiàn)，EGFR在細胞中呈點狀分布并且靠近細胞核。甚至在三維支架培養(yǎng)的細胞中還分布于細胞突起。整體而言，EGFR在細胞中的分布在二維與三維培養(yǎng)下未見明顯差別。

圖3 三維支架上細胞的微管結構和EGFR分布

4. 三維支架上細胞遷移特點
使用共聚焦活細胞成像在16.5h內(nèi)追蹤細胞的移動軌跡，細胞在三維支架中的遷移速度僅為二維培養(yǎng)中的1/2，并且沿支架遷移，這與體內(nèi)遷移模式更加接近。而二維培養(yǎng)細胞遷移的方向更加隨機。

圖4 活細胞追蹤細胞在三維支架上的遷移情況

綜上，作者利用2PP技術制備了“金字塔結構”的三維微支架，可成功用于培養(yǎng)人來源的膠質(zhì)瘤細胞。并且，該支架培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞保留了體內(nèi)組織的特征，可用于體外研究細胞相互作用以及細胞與微環(huán)境之間的相互作用。為膠質(zhì)瘤相關研究提供了一種全新而可靠的研究模型。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/smll.202204485