生物3D打印仿生支架通過雙向調控軟骨內骨化促進肩關節(jié)再生

來源：九院3D打印中心王金武團隊

組織工程被認為是一種有潛力的方法，用于重建生物關節(jié)，尤其是在治療晚期骨關節(jié)炎方面，但目前在大型生物關節(jié)的再生方面還沒有取得重大進展。

本研究利用多噴頭協(xié)同生物打印技術設計和一體化制造了結構差異化、成分異質化、形態(tài)曲面不規(guī)則的大白兔兔肱骨頭再生仿生支架，利用動態(tài)力學加壓協(xié)同不同生化刺激信號實現(xiàn)對軟骨內成骨的雙重調控。這項研究提供了一種多功能且可擴展的修復大型關節(jié)的方法。

仿生支架：用于生物組織工程和再生醫(yī)學的關鍵材料，其設計和制造得與自然生物組織相似。仿生支架在晚期骨關節(jié)炎患者治療中發(fā)揮重要作用。

骨髓間充質干細胞（BMSCs）：是一種很有前途的骨和軟骨組織工程自體細胞來源，通過調節(jié)軟骨內骨化及微環(huán)境中復雜信號的空間調控，從而影響B(tài)MSCs的分化方向促進軟骨細胞生成，這可能極大地有利于肱骨頭的成功重建。

多噴頭協(xié)同生物3D打印技術：是一種新興的生物制造技術，它可以采用多種噴頭將含有不同生長因子和高密度活細胞輸送到水凝膠、大分子和生物材料中，從而創(chuàng)建高度仿生的生物活性結構。研究人員使用這項技術制備具有不同結構、成分的大白兔肱骨頭仿生支架，并進行了肩關節(jié)置換，用以分析術后兔肱骨關節(jié)正常結構再生和功能重建情況。

研究通過計算機斷層掃描(CT)兔肱骨近端肱骨頭獲得3D數(shù)據(jù)設計生物支架。

圖1 基于CAD/CAM技術構建了不同結構和成分的兔肱骨頭支架。A-D）新西蘭白兔左肱骨頭掃描和假體設計效果圖。E-H）分層肱骨頭設計并打印路徑設計。I-L）肱骨頭3D打印的制備過程。M，N）打印模型和物理對象。O，P）肱骨頭的基底視圖和放大圖像。

為了驗證人工肱骨頭的生物相容性，研究人員將每組生物打印支架進行培養(yǎng)1、3、5和7天后用活死細胞染色。BMSC均勻分布在支架之間（圖2A，第3天）。在不同的支架中觀察到高細胞活力和少量死細胞（超過95%），統(tǒng)計分析表明組間沒有顯著差異（圖2B）。此外，細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）測定顯示細胞增殖隨著培養(yǎng)時間的增加而增加。結果表明，所制備的肱骨頭支架具有良好的生物相容性，可用于細胞的長期生長。

圖2 激光共聚焦掃描用于檢測每個支架的生物相容性。A，B）活/死染色顯示細胞在刺激1,3,5和7天時的存活狀態(tài)和細胞存活率，而C）CCK-8測定顯示支架中細胞在1,3,5和7天的刺激下增殖。

為了評估動態(tài)力學加壓協(xié)同不同生化因素對支架中不同區(qū)域骨髓間充質干細胞軟骨形成和軟骨內成骨的影響，研究人員采用RT-PCR來評估透明軟骨相關基因(II型膠原(COL-II)、聚集蛋白(AGG)和Sry相關HMG -9 (SOX9))和纖維軟骨相關基因(I型膠原 (COL-I)、X型膠原 (COL-X)、基質金屬蛋白酶-13 (MMP-13))在體外培養(yǎng)1、7、14天后在不同支架中的表達。結果表明，動態(tài)力學加壓聯(lián)合PTH雙刺激支架能更好地誘導BMSCs成軟骨分化，抑制軟骨內成骨，而動態(tài)力學加壓聯(lián)合羥基磷灰石(HA)可刺激軟骨內成骨的發(fā)育過程，有利于BMSCs體外成骨。

圖3 模擬柱狀支架上軟骨層和下軟骨下骨層軟骨內成骨過程相關基因的表達

為了進一步評估生物3D打印肱骨頭支架在蛋白質水平上雙向調節(jié)BMSCs軟骨內骨化過程的效果，研究人員在體外培養(yǎng)30天后，對不同支架的外層和內層進行了透明軟骨化標志蛋白（COL-II）和纖維軟骨化標志蛋白（COL-X）的免疫熒光染色。結果表明，在動態(tài)力學加壓協(xié)同PTH的聯(lián)合刺激下，軟骨層支架中BMSCs中軟骨內骨化進程受到較好的抑制，快速生成并維持透明軟骨表型；而在在動態(tài)力學加壓刺激協(xié)同HA誘導的組合下，軟骨下骨層支架中BMSCs的軟骨內骨化進程得到顯著促進，快速生成軟骨下骨。

圖4 體外刺激后COL-II和COL-X的免疫熒光分析

為了進一步評估不同刺激對軟骨再生的促進作用，進行了組織學評估，如蘇木精-伊紅染色(he)、Masson–三色染色(Masson)、番紅O/固綠染色(SO/FG)、阿辛藍染色(AB)和甲苯胺藍染色(TB)。結果表明，動態(tài)力學加壓聯(lián)合PTH刺激可協(xié)同促進肱骨頭支架表面軟骨組織的形成。

圖5 各組體外刺激后肱骨頭硬組織切片組織學檢查

通過對肩關節(jié)進行X線和MRI掃描，以評估植入肱骨頭修復體的固定和再生組織的形成。結果顯示，雙刺激組的新生骨體積明顯大于其他三組，MRI也證實所有植入的假體均保留在關節(jié)內，無脫位；且雙刺激組新再生的軟骨組織比生物力學和生化組更厚。

圖6 肱骨頭關節(jié)置換術后4個月肩關節(jié)的X射線和MRI照片，每組都有人造支架。LA：側視圖，AP：前視圖和后視圖，T1：T1加權成像，T2：T1加權成像，PD：質子密度加權像。

為了進一步驗證再生肱骨頭軟骨和骨的形成情況，實驗動物在關節(jié)置換術后4個月安樂死，并收集標本進行大體觀察。

圖7 半肩關節(jié)置換術后肱骨頭軟骨再生的組織學檢查

最后在軟骨下區(qū)域進行HE、Masson、Van Gieson (VG)、SO/FG、AB和TB染色，結果表明，生物力學刺激促進再生軟骨組織的軟骨內成骨過程，加速成熟骨組織的形成。

圖8 體內半肩關節(jié)置換術后肱骨頭軟骨下骨再生的組織學觀察

該研究展示了一種生物3D打印關節(jié)仿生支架，它具有類似于天然肩關節(jié)肱骨頭的各向異性組織結構和多樣化成分。研究通過動態(tài)力學加壓協(xié)同不同生物化學刺激雙向調控干細胞內的軟骨內骨化進程，實現(xiàn)了關節(jié)表層透明軟骨和關節(jié)下骨的一體化再生。這種應用支架架構、生物化學和生物力學協(xié)同刺激的方法可能對大型關節(jié)的高效再生產(chǎn)生深遠影響，有望在動物肩關節(jié)重建以及其他大關節(jié)（如膝蓋、髖部和腕關節(jié)）重建領域取得進展。此方法還為設計和制造大型、解剖匹配的臨床相關植入物提供了一種借鑒方案。該研究通過應用生物力學和生物化學刺激以及各向異性結構，有望進一步推動生物3D打印大關節(jié)的發(fā)展。