微流控氣泡發(fā)生器與數(shù)字光處理平臺（DLP）用于3D多孔生物支架打印

來源： 生物打印與再生工程

3D打印多孔支架的多孔特性使支架具有增強細胞增殖、擴散、遷移以及細胞分化能力的功能，也提高了營養(yǎng)物質(zhì)的運輸或細胞代謝物的去除的效率。但目前常用的犧牲微球法因為涉及溶解犧牲物的多個步驟，具有耗時、靈活性差等問題，也限制了孔尺寸的靈活可控性。而微流控芯片能夠以更簡單、更快、更可控的方式生產(chǎn)多孔結構�；�于以上原因，越來越多的研究正在基于微流控原理開發(fā)生產(chǎn)多孔結構的新技術。

近年來，已有學者將微流控芯片與擠出式打印機結合，雖然該方法操作簡單，但在制造具有復雜內(nèi)部架構和外部形狀的體積結構時，效率往往較低。Yu Shrike Zhang教授團隊選用基于閥門的流量聚焦（vFF）芯片和具有快速交聯(lián)的優(yōu)勢的3D數(shù)字光處理（DLP）打印平臺相結合，從孔隙生成的大小、2D與3D打印的復雜度，支架的生物相容性等方面證實了這項結合技術有望增強天然多孔組織的模仿特性。

圖1 工作中使用的主要組件（A）VFF芯片（B）DLP平臺

一、表面活性劑的選擇
表面活性劑可以降低空氣-液體界面的表面張力，防止氣泡破裂或合并，確保一致的打印質(zhì)量和材料特性。因此，該團隊首先測試了三種表面活性劑（Rhamnolipids、CTAB、Lecithin）對氣泡的穩(wěn)定性的影響。結果表明在0.5%（w/v）和5%（w/v）的濃度下，Rhamnolipids的泡沫穩(wěn)定性最差。相比之下，CTAB在5%（w/v）的濃度下比Lecithin的穩(wěn)定效果更好，但0.5%（w/v）的情況下相反。由于Lecithin穩(wěn)定作用的濃度較低，進一步降低了其潛在的細胞毒性，且在5分鐘即大多數(shù)情況的足夠打印時間內(nèi)表現(xiàn)最好，因此Lecithin被選為本實驗所用的表面活性劑。該團隊隨后進行了濃度梯度實驗（0%、0.5%、1%、3%或5%（w/v），最終選用了1%濃度Lecithin作為最終的表面活性劑選擇。

二、VFF芯片控制氣泡大小的參數(shù)設定探究
VFF芯片的結構如下圖所示，孔口寬度可以通過改變閥門驅(qū)動（valve channel actuation）的壓力大小來控制。在本研究中，該團隊通過改變以下三個要素：墨水流速（Flow rate），氣體通入壓力（Pg）和閥門驅(qū)動的壓力大�。≒v）探究了VFF芯片生成氣泡的大小范圍。

圖2 VFF芯片的通道示意圖

首先，該團隊探究了閥門驅(qū)動的壓力大�。≒v）和孔口寬度之間的函數(shù)關系。結果顯示兩者服從反S形函數(shù)關系，在大氣壓力下，孔口寬度約為100μm。在2.3bar的壓力下，孔完全關閉并在>2.5bar的壓力下斷裂。

接著，該團隊控制Pv為大氣壓強，探究了墨水流速（Flow rate）和氣體通入壓力（Pg）對于氣泡生成的影響。結果表明氣體通入壓力以及墨水流速的不同組合可用于產(chǎn)生直徑均勻、標準差小且尺寸可調(diào)的氣泡，大小從211μm至747μm不等。

之后，該團隊改變閥門驅(qū)動的壓力大小Pv試圖進一步縮小產(chǎn)生的氣泡的尺寸，打破前述的平均約211μm的下限。結果顯示，氣泡尺寸隨著壓力Pv的增加而減小，呈非線性關系，氣泡最小縮小至143μm。同時，該團隊還成功測試了三種參數(shù)的各種組合來證明不同條件下泡沫生成的穩(wěn)健性。

上述實驗結果證明在vFF芯片內(nèi)生成過程中氣泡的大小能夠得到控制，不同工藝參數(shù)的變化范圍從143μm到747μm。

圖3 VFF芯片中不同參數(shù)下孔徑狀態(tài)及氣泡大小

三、2D打印的可行性驗證
光引發(fā)劑可以引起化學交聯(lián)，是實現(xiàn)2D和3D打印性的重要試劑。因此，該團隊對 LAP（phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphonate) 進行了濃度梯度實驗（0.2%、0.4%、1%（w/v），最終選用了1%濃度LAP用于進一步實驗。在405納米光下曝光時間不到15秒即可實現(xiàn)堅固和可重復的交聯(lián)。

該團隊對不同復雜程度的幾何形狀進行了打印，使用的是一套共同的工藝參數(shù)——油墨配方為7.5%（w/v）fGelMA，1%（w/v）卵磷脂，1%（w/v）LAP；flow rate=650μL min-1；pg = 1.3 bar；pv =大氣壓力。實驗結果證明工藝參數(shù)不需要根據(jù)幾何形狀進行優(yōu)化，且印刷時間與結構本身的復雜性無關。

之后，該團隊使用明場顯微鏡采集并展示了可以精確調(diào)整氣泡直徑的2D打印。通過使用50μL min-1的恒定體積流量，變化區(qū)間為100至250mbar的Pg，變化區(qū)間為0至2.25bar的pv，以2D打印了平均直徑為112 ± 7、198 ± 7、239 ± 19、361 ± 17和424 ± 17微米的氣泡并繪制了直方圖。需要注意的是在這些實驗中使用vFF芯片產(chǎn)生的氣泡平均最大直徑可達424微米，而vFF芯片內(nèi)最大的氣泡平均直徑可達747微米。該團隊認為可以歸因于芯片外部的氣泡不再被芯片的高度壓縮，因此變成三維圓形，減少直徑；此外，較大的氣泡一旦處于芯片外的大氣壓力下，往往會不太穩(wěn)定，這在一定程度上導致了氣泡的破裂。

最后，該團隊測試了2D氣泡梯度打印的能力，以更好的實現(xiàn)在3D梯度打印的需求。團隊使用了直接適用于vFF芯片的快速數(shù)字控制，因此可以連續(xù)不中斷的打印氣泡。大型氣泡是用50μL min-1的flow rate和pg = 250 mbar和pv =大氣壓力制備的；中型氣泡的壓力降低到pg = 100 mbar；小型氣泡壓力pv額外增加到2.25bar，以縮小vFF芯片的孔口。在墨水交聯(lián)后，團隊觀察到高度均勻的圓形氣泡，其中大部分是六角填充對齊。

綜上，該團隊研究結果證明，該設備可以在參數(shù)不變的情況下打印復雜幾何結構并在其中生成大小可控的氣泡。同時，它具有梯度連續(xù)打印的能力。

圖4

四、3D打印的可行性驗證
該團隊通過使用自上而下的DLP打印機，進行了復雜程度遞增的幾何形狀的3D打印。并且驗證了將打印結構在細胞培養(yǎng)基中浸泡14天后其結構完整性仍然能夠維持，而不會出現(xiàn)明顯的變形。同時，團隊也指出了如空間分辨率較低和打印結構表面不平整等一些缺陷。

之后，該團隊使用共聚焦熒光顯微鏡與羅丹共軛fGelMA檢查了多孔結構的空間結構。分析顯示孔隙呈最密六邊形排列，且大多數(shù)生成的孔隙已經(jīng)在3D排列中相互連接。之后該團隊對小、中、大孔徑的樣本進行了μCT重建，這些結構相比于共聚焦熒光顯微鏡的結果顯示孔隙度有所減少，該團隊也給出了他們的猜想：一方面，在3D打印時，打印過程中表面張力和其他操作可能導致形成缺陷，導致泡沫墨水中的氣泡不完全緊密包裝。另一方面，在μCT掃描準備樣品期間的處理可能導致結構受到外部力量的影響。

綜上，該團隊證明，盡管3D打印還存在一些缺陷，但生成的多孔結構是精確可調(diào)節(jié)的。3DDLP打印方法能夠生產(chǎn)具有良好均勻性、范圍更廣泛可實現(xiàn)直徑以及更可控和更快的工藝的孔徑。

表1 3D打印的最終參數(shù)匯總

圖5 驗證3D可打印性的打印結構

五、細胞相容性的測試
當涉及到組織工程和再生醫(yī)學的應用時，3D打印的多孔水凝膠結構與種子細胞的細胞相容性對于組織替換至關重要。在此基礎上，團隊通過各種染色方法對細胞活力、增殖、遷移和傳播進行了定性研究。

細胞首先在3D打印的多孔結構中培養(yǎng)了14天，并在1、3、7、10和14天進行活/死檢測以及F-肌動蛋白/核染色。在整個14天的栽培期中，團隊觀察到死細胞的百分比都很低，同時，也在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)細胞從聚集成簇變?yōu)閿U散到占據(jù)支架的大部分。根據(jù)以上的實驗，團隊證明了支架具有良好的生物相容性。

圖6 支架細胞相容性的實驗測試

總結
該實驗了將自上而下的DLP打印機與基于閥門的流量聚焦（vFF）芯片結合，建立了強大的打印流程，并使用細胞染色分析進行了細胞相容性測試，結果表明，多孔結構可以在14天內(nèi)支持細胞生長、擴散、增殖和遷移。由于其物理化學特性，fGelMA作為DLP打印的油墨材料受到青睞。在材料選擇中，選擇了7.5%（w/v）的水溶液fGelMA溶液，1%（w/v）的卵磷脂作為表面活性劑，1%（w/v）的LAP濃度作為光引發(fā)劑。同時，團隊通過調(diào)整油墨流量和氣體壓力、閥門大小，實現(xiàn)了對氣泡尺寸的控制，當前研究顯示的均勻直徑從大到747微米到小到143微米不等�？傮w而言，該實驗成功地在水凝膠基質(zhì)中生成了可調(diào)大小的均勻氣泡，以制造細胞兼容的多孔支架。

參考文獻
(Philipp Weber, Ling Cai et al. 2023)

Philipp Weber, Ling Cai, Francisco Javier Aguilar Rojas, Carlos Ezio Garciamendez-Mijares et al. Microfluidic bubble-generator enables digital light processing 3D printing of porous structures, Aggregate, 2023.

https://doi.org/10.1002/agt2.409