賀永教授團(tuán)隊(duì)：高精度3D打印仿生ECM助力微納結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞行為調(diào)控機(jī)制的探究

來(lái)源：浙江大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院

從物質(zhì)層面看器官的核心組分是細(xì)胞及貫穿于其中的微納結(jié)構(gòu)（通常稱之為ECM，細(xì)胞外基質(zhì)）。ECM是一個(gè)尺度在數(shù)個(gè)微米到幾百納米的復(fù)雜三維網(wǎng)絡(luò)，作為骨架與細(xì)胞協(xié)同，行使并發(fā)揮出器官的功能。一個(gè)重要的科學(xué)問(wèn)題就是微納結(jié)構(gòu)如何對(duì)細(xì)胞施加影響？然而天然的ECM結(jié)構(gòu)微納特征異常復(fù)雜，除了微納結(jié)構(gòu)外還耦合生化信號(hào)，導(dǎo)致目前相關(guān)研究受生化信號(hào)干擾較大，易出現(xiàn)彼此矛盾的研究結(jié)果，不利于量化探究微納結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。

為此，EFL團(tuán)隊(duì)提出使用高精度3D打印手段在體外精確重建具有異質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的工程化ECM，從而消除復(fù)雜生化信號(hào)對(duì)研究的干擾。利用構(gòu)建的工程化ECM可以量化ECM-細(xì)胞相互作用的規(guī)律，推動(dòng)ECM-細(xì)胞相互作用的研究。

相關(guān)研究成果以“Morphology Guided Cellular Behavior Modulation with 3D Printed Engineered ECM”為題，發(fā)表于Cell子刊《Cell Biomaterials》上。浙江大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院賀永教授、孫元博士后為該論文共同通訊作者，劉念博士、史洋博士為該論文共同第一作者。

研究?jī)?nèi)容
該研究主要從三個(gè)視角來(lái)闡明異質(zhì)ECM與細(xì)胞的相互作用：①細(xì)胞更喜愛(ài)哪種形貌的ECM？②ECM中的哪種差異因素驅(qū)動(dòng)了細(xì)胞的選擇偏好？③細(xì)胞如何感知ECM的形貌差異？

解決這三個(gè)問(wèn)題將加深我們對(duì)各種ECM環(huán)境中細(xì)胞偏好的理解。所獲得的見(jiàn)解不僅將推進(jìn)我們對(duì)細(xì)胞行為的基本理解，而且還將為仿生ECM的設(shè)計(jì)和制造提供重要指導(dǎo)。這些進(jìn)步對(duì)于開(kāi)發(fā)更準(zhǔn)確地模仿自然組織復(fù)雜性的人工組織和器官至關(guān)重要，最終有助于提升組織工程與再生醫(yī)學(xué)的成果產(chǎn)出。

1.細(xì)胞更喜愛(ài)哪種形貌的ECM？——細(xì)胞更偏愛(ài)更粗的ECM
利用EFL-BP66013D打印機(jī)制造了直徑分別為20 μm和5 μm的正交纖維網(wǎng)格支架，纖維間距為100 μm，將該區(qū)域劃分為離散的方形區(qū)域。這個(gè)間距明顯大于單個(gè)細(xì)胞的大小，可以清楚地觀察到細(xì)胞對(duì)ECM的識(shí)別過(guò)程。異質(zhì)ECM中的每個(gè)細(xì)胞都類似于小房間中的人，在這種情況下觀察細(xì)胞行為可以深入了解細(xì)胞對(duì)特定ECM特征的偏好。

利用EFL-CV1000活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察儀實(shí)時(shí)原位連續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞行為。觀測(cè)結(jié)果表明在播種后3小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞對(duì)周圍的ECM進(jìn)行識(shí)別和評(píng)估，絕大多數(shù)細(xì)胞逐漸向更粗的ECM遷移和積累。到第4小時(shí)，細(xì)胞停止遷移并開(kāi)始粘附在偏愛(ài)的支架上。在這一階段之后，粘附在支架上的細(xì)胞開(kāi)始增殖，直到實(shí)現(xiàn)融合。

2.ECM誘導(dǎo)特定細(xì)胞行為——細(xì)胞沿著偏愛(ài)的ECM定向排列
異質(zhì)ECM中的細(xì)胞呈現(xiàn)各向異性排列，其方向與粗支架的方向一致。異質(zhì)ECM內(nèi)的細(xì)胞在播種后3小時(shí)內(nèi)識(shí)別了不同的ECM，向粗纖維遷移并積累，最終粘附在粗纖維上。粘附在粗支架上的細(xì)胞自發(fā)地沿著支架軸線方向延伸。隨后，貼壁細(xì)胞開(kāi)始增殖，新細(xì)胞在原有細(xì)胞取向的基礎(chǔ)上依舊沿支架軸線方向延伸，導(dǎo)致所有細(xì)胞定向排列并與粗支架的方向一致。

3.ECM中的哪種差異因素驅(qū)動(dòng)了細(xì)胞的選擇偏好？——ECM的曲率差異，而非黏附位點(diǎn)差異，決定了細(xì)胞的選擇偏好

研究表明粘附位點(diǎn)密度的變化不是選擇性遷移的原因。值得注意的是，無(wú)論ECM表面成分如何，細(xì)胞都保持對(duì)粗支架的偏好，這表明細(xì)胞對(duì)ECM的偏好是由材料成分以外的因素驅(qū)動(dòng)。然而，細(xì)胞在相同曲率的ECM支架內(nèi)呈現(xiàn)各向同性排列，證實(shí)支架曲率差異確實(shí)是選擇性遷移背后的驅(qū)動(dòng)因素。

4.ECM中的哪種差異因素驅(qū)動(dòng)了細(xì)胞的選擇偏好？——細(xì)胞感知ECM的相對(duì)曲率差異

異質(zhì)ECM中的細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)ECM相對(duì)曲率的識(shí)別和響應(yīng)能力，表明細(xì)胞對(duì)曲率變化具有高度敏感性。單個(gè)細(xì)胞類似于水滴，支架上細(xì)胞的形狀由Young-Laplace方程決定。位于低曲率半徑（高曲率）支架上的細(xì)胞承受更大的壓差，導(dǎo)致內(nèi)應(yīng)力增加。此外，當(dāng)細(xì)胞的短軸與纖維方向一致時(shí)，細(xì)胞會(huì)受到拉伸，從而減少其厚度并產(chǎn)生顯著的壓力差，特別是在細(xì)胞的邊緣。在液體體積守恒的約束下，細(xì)胞的勢(shì)能需維持最小化，導(dǎo)致細(xì)胞傾向于將其長(zhǎng)軸定向到與纖維延伸一致的方向。

可以形象地描述為：細(xì)胞不喜歡使自身產(chǎn)生向內(nèi)的卷曲形變，而更傾向于“沒(méi)有壓力地”舒展在平躺的環(huán)境中。和人相似，細(xì)胞也拒絕“被迫地內(nèi)卷”，喜歡“無(wú)壓力地躺平”。

5.細(xì)胞如何感知ECM的形貌差異？——細(xì)胞通過(guò)絲狀偽足感知ECM的相對(duì)曲率差異

片狀偽足（板足），作為細(xì)胞的“手掌”，是細(xì)胞遷移的主要驅(qū)動(dòng)力。不能形成板足的細(xì)胞，其實(shí)現(xiàn)大范圍運(yùn)動(dòng)的能力受損，導(dǎo)致各向同性排列。絲狀偽足，作為細(xì)胞的“手指”，是感知ECM的特殊結(jié)構(gòu)。如果沒(méi)有足夠的絲狀足形成，細(xì)胞就會(huì)失去檢測(cè)支架曲率差異的能力，從而導(dǎo)致沿X軸和Y軸的隨機(jī)遷移和排列。

6.異質(zhì)ECM與細(xì)胞的相互作用——ECM通過(guò)細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力直接調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)
在均質(zhì)ECM中，細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力是全方位的，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力相互抵消形成“力平衡”狀態(tài)。然而，在異質(zhì)ECM中，這些內(nèi)應(yīng)力是定向的；極化的應(yīng)力在整個(gè)系統(tǒng)中積累，每個(gè)細(xì)胞都受到拉伸內(nèi)應(yīng)力，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和空間排列的變化。

7.異質(zhì)ECM與細(xì)胞的相互作用——ECM間接調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和命運(yùn)
ECM可以通過(guò)直接調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)機(jī)械應(yīng)力來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)，甚至細(xì)胞核形態(tài)，從而間接影響細(xì)胞的生理生化狀態(tài)，如基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)合成。

總結(jié)與討論
總之，各向異性ECM提供了細(xì)胞可感知的形態(tài)學(xué)線索。細(xì)胞感知異質(zhì)ECM內(nèi)的相對(duì)曲率差異，并選擇性地向低曲率區(qū)域遷移以建立定向排列。這種細(xì)胞群體的排列導(dǎo)致極化的細(xì)胞間相互作用和細(xì)胞- ECM粘附。由此產(chǎn)生的極化拉伸力改變了單個(gè)細(xì)胞及其細(xì)胞核的形態(tài)。此外，細(xì)胞的這些形態(tài)變化間接影響基因表達(dá)和細(xì)胞命運(yùn)，最終導(dǎo)致不同的生物學(xué)功能。

在理解細(xì)胞行為對(duì)ECM形態(tài)的響應(yīng)方面，各種ECM形態(tài)下的細(xì)胞行為可以類比為社會(huì)環(huán)境中的人類行為。對(duì)人類相互作用的深入了解有助于我們理解細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境的反應(yīng)。本研究研究了細(xì)胞與ECM之間的相互作用，其尺度與細(xì)胞大小（數(shù)十微米）相當(dāng)。在這個(gè)尺度上，細(xì)胞和ECM之間的關(guān)系讓我們聯(lián)想起人與一個(gè)大物體（如床）之間的關(guān)系。正如更大更平坦的床層通常提供更舒適的環(huán)境一樣，低曲率ECM為細(xì)胞提供了更有利的環(huán)境，這解釋了它們選擇性地向低曲率ECM遷移，無(wú)論細(xì)胞或基質(zhì)類型如何。此外，個(gè)體通常沿著矩形床的長(zhǎng)軸平躺，而沿著床的短軸躺下會(huì)使身體的一部分懸空，引起不適。同樣地，沿著ECM延伸的細(xì)胞減少了內(nèi)應(yīng)力，這解釋了它們與ECM延伸方向的對(duì)齊，這有利于維持正常的細(xì)胞形態(tài)。這些相關(guān)的類比有助于更深入地了解細(xì)胞行為，并支持進(jìn)一步研究天然ECM中的細(xì)胞相互作用。

本研究采用工程方法來(lái)解決細(xì)胞生物學(xué)中的基本問(wèn)題，在一定程度上填補(bǔ)了細(xì)胞- ECM形態(tài)相互作用的認(rèn)知空白，并總結(jié)了一系列與細(xì)胞- ECM形態(tài)相互作用相關(guān)的特征，這些特征對(duì)基礎(chǔ)科學(xué)研究和臨床轉(zhuǎn)化具有重要意義。