骨骼干細(xì)胞外泌體裝備3D打印仿生支架修復(fù)骨軟骨缺損

來源：EFL生物3D打印與生物制造

骨軟骨缺損（OCDs）因軟骨無血管特性、結(jié)構(gòu)復(fù)雜性及自我修復(fù)能力有限，成為臨床難題，傳統(tǒng)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）療法受細(xì)胞異質(zhì)性和免疫原性限制，修復(fù)效果不足。來自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院的呂紅斌教授、曹勇副研究員利用單細(xì)胞RNA測(cè)序（ScRNA-seq）從人髕下脂肪墊（IFP）中鑒定出高軟骨分化潛能的骨骼干細(xì)胞（SSCs），提取其外泌體（SSC-Exos）并負(fù)載于3D打印仿生水凝膠支架。該支架通過釋放SSC-Exos中的miR-214-3p抑制JAG2信號(hào)通路，顯著促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）軟骨分化，在大鼠OCD模型中實(shí)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨一體化再生。相關(guān)工作以“3D-printed advanced scaffold armed with exosomes derived from human skeletal stem cell identified by single-cell RNA sequencing enhances osteochondral regeneration”為題發(fā)表在《Bioactive Materials》上。

負(fù)載骨骼干細(xì)胞外泌體的仿生 3D 打印支架構(gòu)建及其用于骨軟骨再生的示意圖。

1. 單細(xì)胞RNA測(cè)序鑒定人髕下脂肪墊骨骼干細(xì)胞亞群，通過單細(xì)胞RNA測(cè)序（ScRNA-seq）和無監(jiān)督聚類分析，研究人髕下脂肪墊（IFP）及皮下脂肪組織（SAT）的細(xì)胞異質(zhì)性。結(jié)果顯示，IFP中存在高表達(dá)PDPN、CD73、CD164的骨骼干細(xì)胞（SSCs）亞群，其分化狀態(tài)更低（CytoTRACE評(píng)分更低），軟骨生成相關(guān)通路（如SOX9、COL2A1）活性顯著高于SAT來源細(xì)胞，且IFP-SSCs的軟骨分化潛能通過Alcian Blue染色和qPCR驗(yàn)證優(yōu)于SAT細(xì)胞。      

圖1. 通過單細(xì)胞RNA測(cè)序鑒定骨骼干細(xì)胞亞群。

2. 骨骼干細(xì)胞外泌體（SSC-Exos）的分離與功能驗(yàn)證，利用流式細(xì)胞術(shù)分選IFP-SSCs并提取外泌體，通過透射電鏡（TEM）、納米顆粒追蹤分析（NTA）和Western blotting表征其形態(tài)（杯狀，粒徑40–160 nm）及標(biāo)志物（CD81、TSG101、CD63陽(yáng)性，Calnexin陰性）。功能實(shí)驗(yàn)表明，SSC-Exos可被骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）高效攝�。≒KH26標(biāo)記顯示紅色熒光聚集于胞質(zhì)），顯著上調(diào)軟骨分化標(biāo)志物SOX9、COL2、ACAN的mRNA和蛋白表達(dá)，且其促分化效果優(yōu)于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（ADSC-Exos）。      

圖2. 骨骼干細(xì)胞外泌體的制備與表征。

3. 3D打印仿生水凝膠支架的制備與性能分析，采用紫外光固化3D打印技術(shù)構(gòu)建負(fù)載SSC-Exos的GelMA支架，通過掃描電鏡（SEM）觀察到支架具有多孔互連結(jié)構(gòu)（孔徑約100–200 μm），能量色散光譜（EDS）證實(shí)外泌體均勻分布于支架內(nèi)部。流變學(xué)測(cè)試顯示，支架儲(chǔ)存模量（G'）在紫外固化后穩(wěn)定高于損耗模量（G''），具備剪切變稀特性；體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，SSC-Exos可持續(xù)釋放28天，累計(jì)釋放率約80%。      

圖 3. 骨骼干細(xì)胞外泌體的體外軟骨形成特性。

4. 支架在大鼠骨軟骨缺損模型中的修復(fù)效果，在大鼠股骨滑車缺損模型中植入SSC-Exos支架，通過大體觀察、micro-CT和組織學(xué)染色（H&E、Safranin O/Fast Green、Masson’s Trichrome）評(píng)估修復(fù)效果。結(jié)果顯示，術(shù)后8周時(shí)，SSC-Exos支架組缺損被新生透明軟骨樣組織完全填充，軟骨下骨骨體積/總體積（BV/TV）和骨小梁數(shù)量（Tb.N）顯著高于對(duì)照組（*P < 0.001*），且免疫組化顯示COL II和ACAN表達(dá)接近正常軟骨水平。      

圖4. 負(fù)載骨骼干細(xì)胞外泌體的3D打印仿生水凝膠支架的表征。   

5. miR-214-3p/JAG2信號(hào)軸調(diào)控機(jī)制研究，通過miRNA測(cè)序篩選出SSC-Exos中高表達(dá)的miR-214-3p，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)其直接靶向JAG2 mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）。功能缺失實(shí)驗(yàn)顯示，抑制miR-214-3p（miR-214-3pIN-Exos）可減弱SSC-Exos對(duì)BMSCs的促軟骨分化作用，而JAG2過表達(dá)則逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)，提示miR-214-3p通過抑制Notch信號(hào)通路配體JAG2，促進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化。   

圖5. 外泌體的體內(nèi)釋放及修復(fù)后骨軟骨缺損的成像分析。

6. 組織修復(fù)的長(zhǎng)期安全性與免疫原性評(píng)估，通過H&E染色觀察心、肝、脾、肺、腎等主要器官，結(jié)果顯示SSC-Exos支架組無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或組織損傷，證實(shí)支架具有良好的生物相容性和低免疫原性。此外，長(zhǎng)期跟蹤（8周）未觀察到腫瘤形成或異常組織增殖。      

圖6. 術(shù)后4周和8周時(shí)不同組修復(fù)組織的組織學(xué)評(píng)估。

研究結(jié)論
本研究開發(fā)了一種基于單細(xì)胞RNA測(cè)序篩選的人髕下脂肪墊骨骼干細(xì)胞外泌體（SSC-Exos）負(fù)載3D打印仿生水凝膠支架的骨軟骨再生策略。通過調(diào)控miR-214-3p/JAG2信號(hào)軸，SSC-Exos顯著促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化，其搭載的3D支架通過多孔結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)外泌體持續(xù)釋放，在大鼠骨軟骨缺損模型中實(shí)現(xiàn)了關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨的一體化再生。組織學(xué)和影像學(xué)結(jié)果顯示，術(shù)后8周修復(fù)組織接近正常結(jié)構(gòu)，軟骨特異性標(biāo)志物COL II和ACAN表達(dá)顯著上調(diào)。該系統(tǒng)結(jié)合外泌體的生物活性與3D打印的定制化優(yōu)勢(shì)，為骨軟骨缺損提供了無細(xì)胞、高安全性的修復(fù)方案，其多通道調(diào)控機(jī)制有望為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供新的思路。

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2025.04.028