體積生物3D打印秒速構建異細胞類骨組織

來源：EFL生物3D打印與生物制造

在組織工程和再生醫(yī)學領域，研發(fā)能模擬生理組織結構和功能的三維細胞構建體意義重大，3D打印與模擬細胞外基質的材料相結合推動了該領域發(fā)展，但傳統(tǒng)基于逐層沉積的3D生物打印技術存在打印時間長、支架孔隙率和構建體尺寸難以滿足臨床需求等問題。  

蘇黎世聯(lián)邦理工學院Xiao-Hua Qin助理教授團隊利用斷層掃描體積生物打印（VBP）技術，將柔軟的明膠甲基丙烯酰化（GelMA）生物樹脂與三維內皮共培養(yǎng)相結合，致力于解決現(xiàn)有問題。研究人員對一系列不同GelMA和光引發(fā)劑濃度的生物樹脂進行了表征，篩選出最佳配方，實現(xiàn)了在30秒內以高細胞活力打印復雜可灌注構建體。同時，研究了內皮共培養(yǎng)對人骨髓間充質干細胞（hMSCs）成骨分化的影響，并成功構建了可灌注的預血管化模型。相關工作以“Tomographic volumetric bioprinting of heterocellular bone-like tissues in seconds”為題發(fā)表在《Acta Biomaterialia》上。該研究為骨組織工程提供了新的策略，有望推動再生醫(yī)學和體外藥物篩選等領域的發(fā)展。

研究內容
1. 斷層掃描體積生物打印構建體的優(yōu)化研究
通過制備不同GelMA濃度和LAP濃度的生物樹脂，進行激光劑量測試、原位光流變測量、機械性能測試以及細胞活性和形態(tài)分析等方法，研究適用于體積生物打?。╒BP）且有利于骨組織工程的生物樹脂配方。結果表明，5% GelMA和0.05% LAP的生物樹脂為最佳配方，其兼具良好的打印性能、較低的剛度，能為細胞提供適宜環(huán)境，促進細胞鋪展和hMSC的成骨分化，且細胞活力大于90%。

圖1. 血管內皮共培養(yǎng)增強VBP和干細胞成骨分化

圖2. VBP打印具有中空通道結構的體外模型

2. 光引發(fā)劑濃度對生物打印影響的探究
運用共聚焦顯微鏡觀察染色后的打印構建體表面、原位光流變監(jiān)測生物樹脂交聯(lián)過程、Zwick機械測試機測定凝膠壓縮模量以及進行細胞活性和形態(tài)學分析等方法，研究不同LAP濃度結合相應光劑量對打印精度、凝膠物理性質和細胞活性的影響。結果顯示，LAP濃度影響生物樹脂的光交聯(lián)效率和剛度，0.05% LAP的生物樹脂綜合性能最佳，在保證打印精度的同時，對細胞活性無顯著不良影響，有利于細胞鋪展。

圖3. 用伊紅Y染色和共聚焦熒光顯微鏡評價印刷結構體的表面光滑度

圖4.LAP光引發(fā)劑濃度對凝膠交聯(lián)、硬度和細胞活性的影響

3. 內皮共培養(yǎng)對hMSC成骨分化的作用研究
采用建立hMSC與HUVEC共培養(yǎng)體系，利用qPCR定量分析成骨和早期成骨細胞標記基因表達、進行ALP活性測定以及監(jiān)測凝膠壓縮模量變化等方法，研究內皮共培養(yǎng)對3D打印構建體中hMSC體外成骨分化和功能的影響。結果表明，共培養(yǎng)體系在成骨早期，多數(shù)成骨標記基因在單培養(yǎng)中表達較高，后期共培養(yǎng)中表達增強，尤其在21天后早期成骨細胞標記基因表達顯著增加，且共培養(yǎng)的凝膠壓縮模量隨時間顯著提高，意味著共培養(yǎng)促進了基質分泌。

圖5. 3D共培養(yǎng)和單培養(yǎng)中骨分化的功能分析  

4. 預血管化構建體的體積生物打印研究
運用設計并打印含hMSC的帶中空通道凝膠構建體，在通道中注入HUVEC細胞懸液，通過共聚焦顯微鏡成像觀察等方法，研究利用VBP技術構建可灌注預血管化骨構建體的可行性。結果顯示，成功構建了通道內有自組織內皮單層的預血管化模型，證明該方法可行，為后續(xù)研究流體誘導的剪切應力對細胞成熟和基質礦化的影響奠定了基礎，但打印分辨率和內皮細胞接種方法仍需優(yōu)化。

圖6. 異細胞可灌注預血管化模型的建立

研究結論
本研究展示了通過斷層掃描體積生物打?。╒BP）技術，結合三維內皮共培養(yǎng)，能快速構建厘米級載細胞水凝膠構建體，促進體外成骨。通過系統(tǒng)篩選生物樹脂成分，確定了5% GelMA和0.05% LAP的軟生物樹脂，其具有良好的打印性和細胞相容性。與10% GelMA的基準生物樹脂相比，該樹脂更柔軟，有利于細胞 - 基質重塑和細胞間通訊。對hMSC/HUVEC三維共培養(yǎng)和hMSC單培養(yǎng)進行六周的功能分析，結果顯示共培養(yǎng)體系在21天后，三維打印構建體中早期成骨細胞標記物（PDPN和DMP1）的表達增強，意味著共培養(yǎng)加速了成骨分化。此外，還成功構建了帶有內皮細胞襯里的可灌注預血管化構建體。

挑戰(zhàn)與展望
本研究雖取得一定成果，但仍面臨挑戰(zhàn)。目前構建體的基質礦化水平有限，且缺乏成熟的成骨細胞基因特征，需要進一步優(yōu)化體外成骨分化策略。未來可通過實施光學調諧方法、引入其他促進成骨的參數(shù)（如與巨噬細胞/破骨細胞共培養(yǎng)、機械刺激）以及升級體外平臺進行機械加載實驗等方式，提高組織成熟度和功能。同時，優(yōu)化VBP的分辨率和內皮細胞接種方法，有助于實現(xiàn)生理微血管化。該共培養(yǎng)VBP平臺有望在再生醫(yī)學和體外藥物發(fā)現(xiàn)等領域，快速規(guī)?；圃旄鼜碗s的人體組織。

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.actbio.2022.06.020